苹果浆细胞的分离原体装有荧光钙试剂,以检测细胞质Ca2+ 浓度。
细胞溶胶 Ca2+在植物开发中起着关键作用。钙成像是检测细胞质中 Ca2+动态变化的最通用方法。在这项研究中,我们通过酶水解获得了纸浆细胞的可行原体。分离的原质在37°C下用小分子荧光试剂(Fluo-4/AM)孵育30分钟。 荧光探针成功地染色了细胞溶胶Ca2+,但没有积聚在真空中。La3+, Ca2+通道阻滞剂, 降低细胞质荧光强度.这些结果表明,Fluo-4/AM可用于检测果肉中细胞溶胶 Ca2+的变化。总之,我们提出了一种方法,通过在果肉细胞的细胞质中加载小分子荧光钙试剂,有效地将原质从水果的肉细胞中分离出来,并检测Ca2+。
Ca2+在植物信号转导和代谢1、2中起着重要作用。此外,它调节水果质量特征3,4,包括硬度,糖含量,和易感性生理障碍在存储过程中5,6。细胞质Ca2+在信号转导中起着重要作用,调节植物生长发育。细胞钙质平衡的干扰可诱发苹果苦坑8个,梨9个棕色斑点病,西红柿脐腐烂10个,影响水果质量,造成严重经济损失3,11。钙成像具有足够的空间和时间分辨率,是观察活细胞12、13中Ca2+动力学的重要方法。
目前,活细胞细胞内钙成像主要有两种方法:一种采用化学小分子荧光探针14,另一种采用基因编码传感器(GECI)15、16。由于在果树中难以建立稳定的转基因系统和更长的果树发育,GECIS不适合果树Ca2+荧光成像。
小分子荧光探针,如Fluo-4/AM有一个特别的优势:他们的AM酯形式(细胞渗透乙酰酯衍生物)可以很容易地批量载入活细胞,而无需转染,这使得它灵活,快速,非细胞毒性17。Fluo-4/AM可以成功地装载到皮鲁斯皮里福利亚18和佩妮,19的花粉管,以及守卫细胞20和根毛的阿拉伯21。
目前,关于纸浆细胞钙荧光染色的报告很少。钙作为一种重要的矿物质元素,在苹果等树果的生长和质量控制中起着关键作用。苹果树被全球公认为重要的经济物种,苹果被认为是一种健康食品。在这项研究中,我们通过酶水解从苹果果浆中获得了可行的原质,然后将小分子荧光试剂装入细胞质中,以检测Ca2+。
在这项研究中,通过酶水解获得了可行的原体。请注意,这种方法需要新鲜的苹果。本协议允许将大量原质从果浆中快速分离,用于研究。此方法的适用性不仅限于”富士”:”杜南”和”蜂蜜脆”的苹果浆的原体也可以通过相同的协议提取(补充图S4)。酶溶解后的前端溶液包含细胞碎片,与以前的方法相比有所改进。作为一种必需的细胞材料,苹果浆原体可用于细胞蛋白表达技术、单细胞…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了山东省农业品种改良项目(2019LZGC007)和山东现代农业产业技术体系果树创新团队(SDAIT-06-05)的支持。
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |