Farvning af cytoplasmisk Ca2+ med Fluo-4/AM i Apple Pulp

Summary

Isolerede protoplaster af æblemasseceller blev lastet med et calcium fluorescerende reagens for at detektere cytoplasmisk Ca^{2+-koncentration.}

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ spiller en central rolle i planteudvikling. Calcium imaging er den mest alsidige metode til at opdage dynamiske ændringer i Ca^{2 +} i cytoplasmaet. I denne undersøgelse opnåede vi levedygtige protoplaster af pulpceller ved enzymatisk hydrolyse. Isolerede protoplaster blev inkuberet med det lille molekyle fluorescerende reagens (Fluo-4/AM) i 30 min ved 37 °C. De fluorescerende sonder med succes plettet cytosolic Ca^{2 +,} men ikke ophobes i vakuoler. La^{3 +,}en Ca^{2 +} kanal blocker, nedsat cytoplasmisk fluorescens intensitet. Disse resultater tyder på, at Fluo-4/AM kan bruges til at opdage ændringer i cytosolic Ca^{2 +} i frugtkødet. Sammenfattende præsenterer vi en metode til effektivt at isolere protoplaster fra kødceller af frugten og detektere Ca^{2 +} ved at indlæse et lille molekyle calcium fluorescerende reagens i cytoplasmaet af pulpceller.

Introduction

Ca²⁺ spiller en vigtig rolle i plantesignaltransduktion og metabolisme^1,2. Desuden regulerer den frugtkvalitetsegenskaber^3,4, herunder hårdhed, sukkerindhold og modtagelighed for fysiologiske lidelser under opbevaring^5,6. Cytoplasmisk Ca²⁺ spiller en vigtig rolle i signaltransduktion og regulerer plantevækst og -udvikling⁷. Forstyrrelse af cellulær calcium homøostase kan fremkalde bitter pit i æbler⁸, brun pletsygdom i pærer⁹og navle råddenskab i tomater¹⁰, påvirker frugtkvaliteten og forårsager alvorlige økonomiske tab^3,11. Calciumbilleddannelse har tilstrækkelig rumlig og tidsmæssig opløsning og er en vigtig metode til at observere Ca^2+-dynamik i levende celler^12,13.

På nuværende tidspunkt er der to hovedmetoder til intracellulær calciumbilleddannelse i levende celler: den ene anvender kemiske små molekylære fluorescerende sonder¹⁴, og den anden er genkodningssensoren (GECI)^15,16. I betragtning af vanskeligheden ved at etablere et stabilt transgent system i frugttræer og længere frugtudvikling er GECI_S uegnet til frugt Ca²⁺ fluorescensbilleddannelse.

Små-molekyle fluorescerende sonder såsom Fluo-4/AM har en særlig fordel: deres AM ester form (celle-permeable acetoxymethyl ester derivat) kan let bulk-læsset i levende celler uden behov for transfection, hvilket gør det fleksibelt, hurtig og ikke-cytotoksisk¹⁷. Fluo-4/AM kunne med succes lastes i pollen rør af Pyrus pyrifolia¹⁸ og Petunia,¹⁹ samt i vagtceller²⁰ og rod hår arabidopsis²¹.

På nuværende tidspunkt er der få rapporter om calcium fluorescens farvning af papirmasse celler²². Som et vigtigt mineralelement spiller calcium en central rolle i væksten og kvalitetskontrol af træfrugter som æbler. Æbletræer er globalt anerkendt som en vigtig økonomisk art, og æbler betragtes som en sund mad²³. I denne undersøgelse opnåede vi levedygtige protoplaster fra æblefrugtmasse gennem enzymatisk hydrolyse og læssede derefter småmolekyler fluorescerende reagenser i cytoplasmaet for at opdage Ca²⁺.

Protocol

1. Protoplastudvinding Den grundlæggende opløsning forberedes: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre og 0,4 M D-sorbitol.BEMÆRK: Basisopløsningens pH-fejl blev justeret til 5,8 med 0,1 M Tris buffer, filtreret gennem 0,22 μm vandopløselige filtre og opbevaret ved 4 °C. Forbered den enzymatiske løsning: Bland 0,3% (w/v) Macerozyme R-10 og 0,5% (w/v) cellulase R-10 med basisopløsningen. Der tilsættes 0,5 mL enzymatisk opløsning i et 1,5 m…

Representative Results

Efter den ovenfor beskrevne protokol brugte vi enzymatisk metode til at opnå levedygtige protoplaster fra pulpen (Figur 1). Nogle protoplaster havde vakuoler, mens andre ikke gjorde. Mens protoplasterne udviste ingen fluorescens, når Ca2 + fluorescerende indikator ikke blev indlæst i dem. Når Fluo-4/AM blev læsset i protoplasterne, cytoplasma, men ikke vakuol, blev fluorescerende (Figur 2). Dette resultat viste, at Fluo-4/AM med succes farvede Ca…

Discussion

I denne undersøgelse blev levedygtige protoplaster opnået ved enzymatisk hydrolyse. Bemærk, at denne metode kræver friske æbler. Denne protokol giver mulighed for hurtig isolering af et stort antal protoplaster fra frugtmasse til brug i forskningsundersøgelser. Anvendelsen af denne metode er ikke begrænset til »Fuji«. protoplasterne på æblemassen af »Dounan« og »Honey Crisp« kan også udvindes ved samme protokol (supplerende figur S4). Protoplastopløsningen efter enzymolyse indeholder cel…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.