Kleuring van de Cytoplasmatische Ca2+ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Summary

Geïsoleerde protoplasten van appelpulpcellen werden geladen met een calciumconsprecerend reagens om cytoplasmatische Ca²⁺ concentratie te detecteren.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ speelt een sleutelrol in de ontwikkeling van planten. Calciumbeeldvorming is de meest veelzijdige methode om dynamische veranderingen in Ca²⁺ in het cytoplasma te detecteren. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten van pulpcellen door enzymatische hydrolyse. Geïsoleerde protoplasten werden geïncubeerd met het fluorescerende reagens met kleine moleculen (Fluo-4/AM) gedurende 30 minuten bij 37 °C. De fluorescerende sondes vlekten met succes cytosolische Ca²⁺ maar hoopten zich niet op in vacuolen. La^3+,een Ca²⁺ kanaalblokker, verminderde de cytoplasmatische fluorescentie-intensiteit. Deze resultaten suggereren dat Fluo-4/AM kan worden gebruikt om veranderingen in cytosolische Ca²⁺ in het vruchtvlees te detecteren. Samenvattend presenteren we een methode om protoplasten effectief te isoleren uit vleescellen van de vrucht en Ca²⁺ te detecteren door een klein molecuul calcium fluorescerend reagens in het cytoplasma van pulpcellen te laden.

Introduction

Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij de transductie en stofwisseling van^{plantensignalen 1,2.} Verder reguleert het de eigenschappen van de fruitkwaliteit^3,4,waaronder hardheid, suikergehalte en gevoeligheid voor fysiologische stoornissen tijdens opslag^5,6. Cytoplasmatisch Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie en reguleert de groei en ontwikkeling van planten⁷. Verstoring van cellulaire calciumhomeostase kan bittere pit in appels^{veroorzaken 8,}bruine vlekkenziekte in peren⁹en navelstrengrot in tomaten^10,waardoor de fruitkwaliteit wordt aangetast en ernstige economische verliezen worden veroorzaakt^3,11. Calciumbeeldvorming heeft voldoende ruimtelijke en temporele resolutie en is een belangrijke methode voor het observeren van Ca²⁺ dynamiek in levende cellen^12,13.

Op dit moment zijn er twee hoofdmethoden voor intracellulaire calciumbeeldvorming in levende cellen: de ene maakt gebruik van chemische kleinmoleculaire fluorescerende sondes¹⁴en de andere is de gencoderingssensor (GECI)^15,16. Gezien de moeilijkheid om een stabiel transgeen systeem in fruitbomen en een langere vruchtontwikkeling tot stand te brengen, is GECI_S ongeschikt voor beeldvorming van fruit Ca²⁺ fluorescentie.

Fluorescentiesondes met kleine moleculen zoals Fluo-4 / AM hebben een bijzonder voordeel: hun AM-estervorm (celdoorlatend acetoxymethylesterderivaat) kan gemakkelijk in bulk in levende cellen worden geladen zonder de noodzaak van transfectie, waardoor het flexibel, snel en niet-cytotoxisch^{is 17}. Fluo-4/AM kon met succes worden geladen in de stuifmeelbuis van Pyrus pyrifolia¹⁸ en Petunia,^19, evenals in wachtcellen²⁰ en wortelhaar van Arabidopsis²¹.

Op dit moment zijn er weinig rapporten over de calciumfluorescentiekleuring van pulpcellen²². Als belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol bij de groei en kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appels. Appelbomen worden wereldwijd erkend als een belangrijke economische soort en appels worden beschouwd als een gezond voedsel²³. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten uit appelvruchtpulp door middel van enzymatische hydrolyse en laadden vervolgens fluorescerende reagentia met kleine moleculen in het cytoplasma om Ca^{2 +}te detecteren.

Protocol

1. Protoplast extractie Bereid de basisoplossing: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur en 0,4 M D-sorbitol.OPMERKING: De pH van de basisoplossing werd aangepast naar 5,8 met 0,1 M Tris-buffer, gefilterd door 0,22 μm in water oplosbare filters en bewaard bij 4 °C. Bereid de enzymatische oplossing voor: Meng 0,3% (w / v) MacerozymE R-10 en 0,5% (w / v) cellulase R-10 met de basisoplossing. Voeg 0,5 ml enzymatische oplossing toe aan een centrifugeb…

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol gebruikten we de enzymatische methode om levensvatbare protoplasten uit de pulp te verkrijgen(figuur 1). Sommige protoplasten hadden vacuolen, terwijl anderen dat niet deden. Terwijl de protoplasten geen fluorescentie vertoonden wanneer de Ca2+ fluorescerende indicator er niet in werd geladen. Toen Fluo-4/AM in de protoplasten werd geladen, werd het cytoplasma, maar niet de vacuole, fluorescerend (figuur 2). D…

Discussion

In deze studie werden levensvatbare protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. Merk op dat deze methode verse appels vereist. Het huidige protocol maakt de snelle isolatie van een groot aantal protoplasten uit vruchtenpulp mogelijk voor gebruik in onderzoeksstudies. De toepasbaarheid van deze methode is niet beperkt tot ‘Fuji’; de protoplasten van de appelpulp van ‘Dounan’ en ‘Honey Crisp’ kunnen ook via hetzelfde protocol worden geëxtraheerd (aanvullende figuur S4). De protoplastoplossing na e…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.