מכתים את הציטופלסמי Ca2+ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

Summary

פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca^{2 +} .

Abstract

Cytosolic Ca^{2 +} ממלא תפקיד מפתח בפיתוח הצמח. הדמיית סידן היא השיטה המגוונת ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ב- Ca²⁺ בציטופלסמה. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא של תאי עיסת על ידי הידרוליזה אנזימטית. פרוטופלסטים מבודדים דוגרו עם ריאגנט פלואורסצנטי מולקולה קטנה (פלואו-4/AM) במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הבדיקות הפלואורסצנטיות הכתימו בהצלחה את Ca²⁺ הציטוזולי, אך לא הצטברו בווליות. La³⁺, חוסם ערוץ Ca²⁺ , ירד עוצמת פלואורסצנטיות ציטופלסמית. תוצאות אלה מציעות כי Fluo-4/AM ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים Ca ציטוטוסולי^{2 +} בבשר הפרי. לסיכום, אנו מציגים שיטה לבודד ביעילות פרוטופלסטים מתאי בשר של הפרי ולזהות Ca²⁺ על ידי טעינת ריאגנט סידן פלואורסצנטי במולקולה קטנה בציטופלסמה של תאי עיסת.

Introduction

Ca^{2 +} ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות צמחים ומטבוליזם^1,2. כמו כן, הוא מסדיר תכונות איכות פירות^3,4 , כולל^קשיות,תכולת הסוכר, ורגישות להפרעות פיזיולוגיות במהלך אחסון^5,6. ציטופלסמי Ca²⁺ ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות ומווסת את צמיחת הצמח ופיתוח⁷. הפרעה של הומאוסטזיס סידן הסלולר יכול לגרום לבור מר בתפוחים⁸, מחלת כתם חום באגסים⁹, וריקבון טבור בעגבניות¹⁰, המשפיעים על איכות הפרי וגורמים להפסדים כלכליים חמורים^3,11. להדמיית סידן יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית מספקת והיא שיטה חשובה להתבוננות בדינמיקה Ca²⁺ בתאים חיים^12,13.

נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות להדמיית סידן תאי בתאים חיים: האחת משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות קטנות-מולקולריות כימיות¹⁴, והשנייה היא חיישן קידוד הגנים (GECI)^15,16. בהתחשב בקושי להקים מערכת מהונדסת יציבה בעצי פרי ופיתוח פירות ארוך יותר, GECI_S אינו מתאים להדמיית פלואורסצנטיות של פירות Ca²⁺ .

למולקולות פלואורסצנטיות קטנות כגון Fluo-4/AM יש יתרון מסוים: צורת אסתר AM שלהן (נגזרת אסתר אצטוקסימתיל חדיר לתא) יכולה להיות נטענת בקלות בתפזורת לתאים חיים ללא צורך בהדבקה, מה שהופך אותה לגמישה, מהירה ולא ציטוקסית¹⁷. Fluo-4/AM יכול להיות טעון בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia¹⁸ ו Petunia,^19, כמו גם לתוך תאי שמירה²⁰ ושיער שורש של Arabidopsis²¹.

נכון לעכשיו, ישנם דיווחים מעטים על הכתמת פלואורסצנטיות סידן של תאי עיסת²². כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוחים. עצי תפוח מוכרים ברחבי העולם כמין כלכלי חשוב, ותפוחים נחשבים למזון בריא²³. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא מעיסת פירות תפוחים דרך הידרוליזה אנזימטית ולאחר מכן העמסנו ריאגנטים פלואורסצנטיים של מולקולות קטנות לתוך הציטופלסמה כדי לזהות Ca^{2 +}.

Protocol

1. מיצוי פרוטופלסט הכן את הפתרון הבסיסי: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנולפונית, ו 0.4 M D-סורביטול.הערה: ה- pH של הפתרון הבסיסי הותאם ל- 5.8 עם חיץ טריס של 0.1 M, סונן באמצעות מסננים מסיסים במים בגודל 0.22 מיקרומטר ואוחסנו ב- 4 °C (70 °F). הכן את הפתרון אנזימטי: לערבב 0.3%(w/v) Macerozyme…

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו בשיטה אנזימטית כדי להשיג פרוטופלסטים ברי קיימא מהעיסה (איור 1). לחלק מהנורות היו חלילות, בעוד שאחרים לא. בעוד הפרוטופלסטים לא הראו פלואורסצנטיות כאשר מחוון הפלואורסצנטי Ca2 + לא נטען לתוכם. כאשר פלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסטים, הצ?…

Discussion

במחקר זה, פרוטופלסטים קיימא התקבלו על ידי הידרוליזה אנזימטית. שימו לב כי שיטה זו דורשת תפוחים טריים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בידוד מהיר של מספר רב של פרוטופלסטים מעיסת פירות לשימוש במחקרים. תחולתה של שיטה זו אינה מוגבלת ל’פוג’י’; את הפרוטופלסטים של עיסת התפוחים של ‘Dounan’ ו’דבש קריספ’ ניתן לחלץ ?…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.