सेब लुगदी कोशिकाओं के अलग प्रोटोप्लास्ट को साइटोप्लाज्मिक सीए2 + एकाग्रता का पता लगाने के लिए कैल्शियम फ्लोरोसेंट रिएजेंट से भरा गया था।
साइटोसोलिक सीए2 + पौधों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। साइटोप्लाज्म में सीए2 + में गतिशील परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कैल्शियम इमेजिंग सबसे बहुमुखी विधि है। इस अध्ययन में, हमने एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस द्वारा लुगदी कोशिकाओं के व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए। अलग-थलग पड़े प्रोटोप्लास्ट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोटे अणु फ्लोरोसेंट रिएजेंट (फ्लूो-4/AM) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । फ्लोरोसेंट जांच सफलतापूर्वक साइटोसोलिक सीए2 + दाग लेकिन vacuoles में जमा नहीं किया । ला3 +,एक सीए2 + चैनल अवरोधक, साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस तीव्रता में कमी आई। इन परिणामों से पता चलता है कि फ्लोर-4/AM का उपयोग फलों के मांस में साइटोसोलिक सीए2 + में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है । संक्षेप में, हम फल की मांस कोशिकाओं से प्रोटोप्लास्ट को प्रभावी ढंग से अलग करने और लुगदी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में एक छोटे-अणु कैल्शियम फ्लोरोसेंट रिएजेंट लोड करके सीए2 + का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
सीए2 + पौधों के सिग्नल ट्रांसडक्शन और मेटाबॉलिज्म 1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, यह3,4फलों की गुणवत्ता को नियंत्रित करता है, जिसमें कठोरता, चीनी सामग्री और भंडारण5, 6केदौरानशारीरिक विकारों के प्रति संवेदनशीलता शामिल है। साइटोप्लाज्मिक सीए2 + सिग्नल ट्रांसडक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और पौधों के विकास और विकास 7 कोनियंत्रितकरता है। सेलुलर कैल्शियम होयोस्टेसिस की गड़बड़ी सेब में कड़वे गड्ढे को प्रेरित कर सकती है8, नाशपाती9में भूरे रंग की बीमारी और टमाटर में नाभि सड़ांध10, फलों की गुणवत्ता को प्रभावित कर रही है और गंभीर आर्थिक नुकसान पहुंचा सकती है3,11 कैल्शियम इमेजिंग में पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प होता है और यह जीवित कोशिकाओं में सीए2 + गतिशीलता को देखने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है12,13।
वर्तमान में, जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेलुलर कैल्शियम इमेजिंग के लिए दो मुख्य तरीके हैं: एक रासायनिक छोटे आणविक फ्लोरोसेंट जांच14को नियोजित करता है, और दूसरा जीन एन्कोडिंग सेंसर (जीईसीआई)15,16है। फलों के पेड़ों और लंबे फलों के विकास में एक स्थिर ट्रांसजेनिक प्रणाली स्थापित करने की कठिनाई को देखते हुए, जीईसीआईएस फल Ca2 + फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त है।
फ्लोरो-4/एएम जैसे छोटे-अणु फ्लोरोसेंट जांच का एक विशेष लाभ है: उनके एएम एस्टर फॉर्म (सेल-पारगम्य एसीटॉक्सीमिथाइल एस्टर डेरिवेटिव) ट्रांसफैक्शन की आवश्यकता के बिना जीवित कोशिकाओं में आसानी से थोक-लोड किया जा सकता है, जो इसे लचीला, तेज और गैर-साइटोटॉक्सिक17बनाता है। फ्लू-4/AM सफलतापूर्वक Pyrus pyrifolia18 और Petunia,19 के पराग ट्यूब में लोड किया जा सकता है और साथ ही गार्ड कोशिकाओं में20 और अरबीडोप्सिस21के जड़ बाल ।
वर्तमान में, लुगदी कोशिकाओं के कैल्शियम फ्लोरेसेंस स्टेनिंग पर कुछ रिपोर्टें हैं22। एक महत्वपूर्ण खनिज तत्व के रूप में, कैल्शियम सेब जैसे पेड़ फलों के विकास और गुणवत्ता नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेब के पेड़ विश्व स्तर पर एक महत्वपूर्ण आर्थिक प्रजातियों के रूप में पहचाने जाते हैं, और सेब एक स्वस्थ भोजन23माना जाता है । इस अध्ययन में, हमने एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के माध्यम से सेब के फल लुगदी से व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए और फिर सीए2 +का पता लगाने के लिए साइटोप्लाज्म में छोटे अणु फ्लोरोसेंट रिएजेंट्स को लोड किया।
इस अध्ययन में एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस द्वारा व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए गए थे। ध्यान दें कि इस विधि के लिए ताजा सेब की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल अनुसंधान अध्ययन में उपयोग के लिए ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को शेंडोंग प्रांत (2019LZGC007) की कृषि विविधता सुधार परियोजना और शेंडोंग आधुनिक कृषि उद्योग प्रौद्योगिकी प्रणाली (एसडीआईटी-06-05) के फल पेड़ नवाचार टीम द्वारा समर्थित किया गया था।
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |