リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質Ca2+ 濃度を検出するためにカルシウム蛍光試薬を装填した。
サイトソリックCa2+は、植物開発において重要な役割を果たしています。カルシウムイメージングは、細胞質におけるCa2+の動的変化を検出する最も汎用性の高い方法です。本研究では、酵素加水分解によりパルプ細胞の生き生き可能なプロトプラストを得た。単離したプロトプラストを37°Cで30分間、低分子蛍光試薬(Fluo-4/AM)でインキュベートした。 蛍光プローブは細胞細胞系Ca2+の染色に成功したが、液胞に蓄積しなかった。Ca3+、Ca2+チャネルブロッカーは、細胞質蛍光強度を低下した。これらの結果は、Fluo-4/AMが果実肉における細胞質Ca2+の変化を検出するために使用できることを示唆している。要約すると、果実の果実の果体細胞からプロトプラストを効果的に単離し、小分子カルシウム蛍光試薬をパルプ細胞の細胞質に負荷させることでCa2+を検出する方法を提示する。
Ca2+は植物のシグナル伝達と代謝に重要な役割を果たす1,2 .また、それは、貯蔵中の硬度、糖度、および生理障害に対する感受性を含む果物品質形質3、4を調節する5、6。細胞質Ca2+は、シグナル伝達に重要な役割を果たし、植物の成長と開発を調節する7.細胞カルシウム恒常性の乱れは、リンゴ8、梨9の褐色スポット病、トマト10の臍帯病に苦いピットを誘発し、果実の質に影響を及ぼし、深刻な経済的損失を引き起こす3、11。カルシウムイメージングは十分な空間的および時間的分解能を有し、生細胞12,13におけるCa2+ダイナミクスを観察するための重要な方法である。
現在、生細胞における細胞内カルシウムイメージングには主に2つの方法がある:一方は化学小分子蛍光プローブ14を採用し、もう1つは遺伝子コードセンサ(GECI)15,16である。果樹における安定したトランスジェニックシステムの確立と長い果実の開発の難しさを考えると、GECISはフルーツCa2+蛍光イメージングには適していません。
Fluo-4/AMのような低分子蛍光プローブは特に利点があります:そのAMエステル形態(細胞透過性アセトキシメチルエステル誘導体)は、トランスフェクションを必要とせずに生細胞に容易にバルクロードすることができ、柔軟で迅速で非細胞毒性の17になります。Fluo-4/AMは、ピルス・ピリフォリア18とペチュニア、19の花粉管に正常にロードすることができ、また、アビニズナプシス21のガードセル20と根髪に入れることができました。
現在のところ、パルプ細胞22のカルシウム蛍光染色に関する報告はほとんどない。重要なミネラル成分として、リンゴなどの樹果の成長と品質管理においてカルシウムが重要な役割を果たします。リンゴの木は世界的に重要な経済種として認識されており、リンゴは健康的な食品23と考えられています。本研究では、リンゴ果実パルプから酵素加水分解を介して生存可能なプロトプラストを得てから、細胞質に低分子蛍光試薬をロードしてCa2+を検出した。
本研究では、生き生きとしたプロトプラストを酵素加水分解により得た。この方法には新鮮なリンゴが必要であることに注意してください。本プロトコルは、研究研究で使用するために、果肉から多数のプロトプラストを迅速に分離することを可能にする。この方法の適用可能性は「富士」に限定されません。「ドゥーナン」と「ハニークリスプ」のリンゴパルプのプロトプラストも同じプ?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、山東省農業品種改良プロジェクト(2019LZGC007)と山東省現代農業産業技術システム(SDAIT-06-05)の果樹イノベーションチームによって支援されました。
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |