Manchando o Ca2+ Citoplasmado com Fluo-4/AM em Celulose de Maçã

Summary

Protoplastias isolados de células de celulose de maçã foram carregados com um reagente fluorescente de cálcio para detectar concentração de Ca²⁺ citoplasmática.

Abstract

O Cítosol Ca²⁺ desempenha um papel fundamental no desenvolvimento das plantas. A imagem de cálcio é o método mais versátil para detectar alterações dinâmicas no Ca²⁺ no citoplasma. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis de células polpais por hidrólise enzimática. Protoplastias isolados foram incubados com o reagente fluorescente de pequenas moléculas (Fluo-4/AM) por 30 min a 37 °C. As sondas fluorescentes mancharam com sucesso o Ca²⁺ citosol, mas não se acumularam em vacúolos. La³⁺, um bloqueador de canal Ca^2+, diminuiu a intensidade de fluorescência citoplasmática. Esses resultados sugerem que o Fluo-4/AM pode ser usado para detectar alterações no Ca²⁺ citosolico na carne de fruta. Em resumo, apresentamos um método para isolar efetivamente protoplastos das células carníolas da fruta e detectar o Ca²⁺ carregando um reagente fluorescente de cálcio de pequenas moléculas no citoplasma das células de polpa.

Introduction

O Ca²⁺ desempenha um papel importante na transdução de sinal vegetal e no metabolismo^1,2. Além disso, regula os traços de qualidade da fruta^3,4, incluindo dureza, teor de açúcar e suscetibilidade a distúrbios fisiológicos durante o armazenamento^5,6. O Ca²⁺ citoplasmado desempenha um papel importante na transdução de sinais e regula o crescimento e o desenvolvimento das plantas⁷. A perturbação da homeostase de cálcio celular pode induzir o poço amargo nas maçãs⁸, doença da mancha marrom nas peras⁹e podridão umbilical no tomate¹⁰, afetando a qualidade da fruta e causando severas perdas econômicas^3,11. A imagem de cálcio tem resolução espacial e temporal suficiente e é um método importante para observar a dinâmica ca²⁺ em células vivas^12,13.

Atualmente, existem dois métodos principais para a imagem intracelular de cálcio em células vivas: um emprega sondas fluorescentes químicas de pequeno porte molecular¹⁴, e o outro é o sensor de codificação genética (GECI)^15,16. Dada a dificuldade de estabelecer um sistema transgênico estável em árvores frutíferas e desenvolvimento de frutas mais longas, o GECI_S é inadequado para a imagem de fluorescência ca²⁺ frutífera.

Sondas fluorescentes de pequenas moléculas como o Fluo-4/AM têm uma vantagem particular: sua forma de éster AM (derivado de éster acetoximetila permeável celular) pode ser prontamente carregada em massa em células vivas sem a necessidade de transfecção, o que a torna flexível, rápida e não citotóxica¹⁷. Fluo-4/AM poderia ser carregado com sucesso no tubo de pólen de Pyrus pyrifolia¹⁸ e Petúnia,^19, bem como em células de guarda²⁰ e cabelo raiz de Arabidopsis²¹.

Atualmente, há poucos relatos sobre a coloração da fluorescência de cálcio das células^{de polpa 22}. Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e controle de qualidade de frutos das árvores, como maçãs. As macieiras são reconhecidas mundialmente como uma espécie econômica importante, e as maçãs são consideradas um alimento saudável²³. Neste estudo, obtivemos protoplastos viáveis da polpa de frutas de maçã através da hidrólise enzimática e, em seguida, carregamos reagentes fluorescentes de pequenas moléculas no citoplasma para detectar Ca²⁺.

Protocol

1. Extração de protoplastia Prepare a solução básica: 20 mM CaCl2, 5 mM 2-(N-morpholino)ácido estilesullfônico e 0,4 M D-sorbitol.NOTA: O pH da solução básica foi ajustado para 5,8 com tampão tris de 0,1 M, filtrado através de filtros solúveis em água de 0,22 μm e armazenado a 4 °C. Prepare a solução enzimática: Misture 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 e 0,5%(w/v) cellulase R-10 com a solução básica. Adicione 0,5 mL de solução enzimática em u…

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, utilizou-se o método enzimático para obter protoplastos viáveis da polpa (Figura 1). Alguns protoplastos tinham vacuoles, enquanto outros não. Enquanto os protoplastos não apresentaram fluorescência quando o indicador fluorescente Ca2+ não foi carregado neles. Quando o Fluo-4/AM foi carregado nos protoplastos, o citoplasma, mas não o vacuole, tornou-se fluorescente(Figura 2). Este resultado indicou que o Fl…

Discussion

Neste estudo, protoplastos viáveis foram obtidos por hidrólise enzimática. Observe que este método requer maçãs frescas. O presente protocolo permite o rápido isolamento de um grande número de protoplastos da polpa de frutas para uso em estudos de pesquisa. A aplicabilidade deste método não se limita a ‘Fuji’; os protoplastos da polpa de maçã de ‘Dounan’ e ‘Honey Crisp’ também podem ser extraídos através do mesmo protocolo(Figura Suplementar S4). A solução protoplasta após a enzima cont…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.