Los protoplastos aislados de células de pulpa de manzana se cargaron con un reactivo fluorescente de calcio para detectar la concentración citoplasmática de Ca2+.
El Ca2+ citosólico juega un papel clave en el desarrollo de las plantas. La imagen de calcio es el método más versátil para detectar cambios dinámicos en Ca2+ en el citoplasma. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de células pulpares por hidrólisis enzimática. Los protoplastos aislados se incubaron con el reactivo fluorescente de molécula pequeña (Fluo-4/AM) durante 30 min a 37 °C. Las sondas fluorescentes tiñeron con éxito el Ca2+ citosólico pero no se acumularon en las vacuolas. La3+,un bloqueador de los canales de Ca2+, disminuyó la intensidad de la fluorescencia citoplasmática. Estos resultados sugieren que Fluo-4 / AM se puede utilizar para detectar cambios en ca2 + citosólico en la pulpa de la fruta. En resumen, presentamos un método para aislar eficazmente los protoplastos de las células de la carne de la fruta y detectar Ca2+ cargando un reactivo fluorescente de calcio de molécula pequeña en el citoplasma de las células pulpares.
Ca2+ juega un papel importante en la transducción de señales y el metabolismode las plantas 1,2. Además, regula los rasgos de calidad de la fruta3,4, incluida la dureza, el contenido de azúcar y la susceptibilidad a los trastornos fisiológicos durante el almacenamiento5,6. El Ca2+ citoplasmático juega un papel importante en la transducción de señales y regula el crecimiento y desarrollo de las plantas7. La alteración de la homeostasis del calcio celular puede inducir hueso amargo en manzanas8,enfermedad de manchas marrones en peras9y pudrición umbilical en tomates10,afectando la calidad de la fruta y causando graves pérdidas económicas3,11. Las imágenes de calcio tienen suficiente resolución espacial y temporal y es un método importante para observar la dinámica de Ca2+ en células vivas12,13.
En la actualidad, hay dos métodos principales para la obtención de imágenes de calcio intracelular en células vivas: uno emplea sondas fluorescentes químicas de pequeño molecular14, y el otro es el sensor de codificación de genes (GECI)15,16. Dada la dificultad de establecer un sistema transgénico estable en los árboles frutales y un desarrollo más largo de la fruta, GECIS no es adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia Ca2+ de la fruta.
Las sondas fluorescentes de moléculas pequeñas como Fluo-4/AM tienen una ventaja particular: su forma de éster AM (derivado del acetoximetilo éster permeable a las células) puede cargarse fácilmente a granel en las células vivas sin necesidad de transfección, lo que la hace flexible, rápida y no citotóxica17. Fluo-4 / AM podría cargarse con éxito en el tubo de polen de Pyrus pyrifolia18 y Petunia,19, así como en las células de guardia20 y el vello de la raíz de Arabidopsis21.
En la actualidad, hay pocos informes sobre la tinción de fluorescencia de calcio de las células pulpares22. Como elemento mineral importante, el calcio juega un papel clave en el crecimiento y control de calidad de los frutos de los árboles como las manzanas. Los manzanos son reconocidos mundialmente como una especie económica importante, y las manzanas se consideran un alimento saludable23. En este estudio, obtuvimos protoplastos viables de pulpa de fruta de manzana a través de hidrólisis enzimática y luego cargamos reactivos fluorescentes de moléculas pequeñas en el citoplasma para detectar Ca2 +.
En este estudio, se obtuvieron protoplastos viables por hidrólisis enzimática. Tenga en cuenta que este método requiere manzanas frescas. El presente protocolo permite el aislamiento rápido de un gran número de protoplastos de pulpa de fruta para su uso en estudios de investigación. La aplicabilidad de este método no se limita a ‘Fuji’; los protoplastos de la pulpa de manzana de ‘Dounan’ y ‘Honey Crisp’ también se pueden extraer a través del mismo protocolo(Figura suplementaria S4). La solución…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Mejora de Variedades Agrícolas de la Provincia de Shandong (2019LZGC007) y el equipo de innovación de árboles frutales del sistema de tecnología de la industria agrícola moderna de Shandong (SDAIT-06-05).
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |