Färgning av cytoplasmic Ca2+ med Fluo-4/AM i Äppelmassa

Summary

Isolerade protoplaster av äppelmassa celler laddades med en kalcium fluorescerande reagens för att upptäcka cytoplasmic Ca^{2 +} koncentration.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ spelar en nyckelroll i växtutvecklingen. Kalciumavbildning är den mest mångsidiga metoden för att upptäcka dynamiska förändringar i Ca²⁺ i cytoplasman. I denna studie erhöll vi livskraftiga protoplaster av massaceller genom enzymatisk hydrolys. Isolerade protoplaster inkuberades med småmolekylen fluorescerande reagens (Fluo-4/AM) i 30 min vid 37 °C. Fluorescerande sonder framgångsrikt färgade cytosolic Ca^{2 +} men ackumulerades inte i vacuoles. La^{3 +}, en Ca^{2 +} kanalblockerare, minskad cytoplasmisk fluorescensintensitet. Dessa resultat tyder på att Fluo-4/AM kan användas för att upptäcka förändringar i cytosolic Ca²⁺ i fruktköttet. Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för att effektivt isolera protoplaster från köttceller i frukten och upptäcka Ca^{2 + genom} att ladda ett kalcium fluorescerande reagens med små molekyler i cytoplasman i massaceller.

Introduction

Ca^{2 +} spelar en viktig roll i växtsignaltransduktion och metabolism^1,2. Vidare reglerar det fruktkvalitetsegenskaper^3,4, inklusive hårdhet, sockerhalt och mottaglighet för fysiologiska störningar under^{lagring 5,6}. Cytoplasmic Ca²⁺ spelar en viktig roll i signaltransduktion och reglerar växttillväxt och utveckling⁷. Störningar av cellulär kalciumhomeostas kan inducera bitter grop i äpplen^8,brun fläcksjukdom hos päron⁹, och navelrot i tomater¹⁰, vilket påverkar fruktkvaliteten och orsakar allvarliga ekonomiska förluster^3,11. Kalciumavbildning har tillräcklig rumslig och tidsmässig upplösning och är en viktig metod för att observera Ca^{2 + dynamik} i levande^{celler 12,13}.

För närvarande finns det två huvudmetoder för intracellulär kalciumavbildning i levande celler: den ena använder kemiska småmolekylära fluorescerande^{sonder 14}, och den andra är genkodningssensorn (GECI)^15,16. Med tanke på svårigheten att etablera ett stabilt transgent system i fruktträd och längre fruktutveckling är GECI_S olämpligt för frukt Ca^{2 +} fluorescensavbildning.

Småmolekylära fluorescerande sonder som Fluo-4/AM har en särskild fördel: deras AM-esterform (cellpermeabel acetoxymethylesterderivat) kan lätt bulklastas i levande celler utan behov av transfection, vilket gör den flexibel, snabb och icke-cytotoxisk¹⁷. Fluo-4/AM kan framgångsrikt laddas i pollenröret i Pyrus pyrifolia¹⁸ och Petunia,¹⁹ samt i skyddsceller^{20 och} rothår av Arabidopsis²¹.

För närvarande finns det få rapporter om kalcium fluorescens färgning av massa celler²². Som ett viktigt mineralelement spelar kalcium en nyckelroll i tillväxten och kvalitetskontrollen av trädfrukter som äpplen. Äppelträd är globalt erkända som en viktig ekonomisk art, och äpplen anses vara en hälsosam mat²³. I denna studie erhöll vi livskraftiga protoplaster från äppelfruktmassa genom enzymatisk hydrolys och laddade sedan småmolekyls fluorescerande reagenser i cytoplasman för att upptäcka Ca^{2 +}.

Protocol

1. Protoplast extraktion Förbered den grundläggande lösningen: 20 mM CaCl2,5 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonsyra och 0,4 M D-sorbitol.OBS: Baslösningens pH-tal justerades till 5,8 med 0,1 M Tris-buffert, filtrerades genom 0,22 μm vattenlösliga filter och lagrades vid 4 °C. Förbered den enzymatiska lösningen: Blanda 0,3%(w/v) Macerozyme R-10 och 0,5%(w/v) cellulase R-10 med den grundläggande lösningen. Tillsätt 0,5 ml enzymatisk lösning i ett 1,5 ml…

Representative Results

Enligt det protokoll som beskrivs ovan använde vi den enzymatiska metoden för att erhålla livskraftiga protoplaster från massan (Figur 1). Vissa protoplaster hade vacuoles, medan andra inte. Medan protoplasterna inte uppvisade någon fluorescens när Ca2 + fluorescerande indikatorn inte laddades i dem. När Fluo-4/AM laddades in i protoplasterna blev cytoplasman, men inte vacuole, fluorescerande (figur 2). Detta resultat anges att Fluo-4/AM framg?…

Discussion

I denna studie erhölls livskraftiga protoplaster genom enzymatisk hydrolys. Observera att den här metoden kräver färska äpplen. Detta protokoll möjliggör snabb isolering av ett stort antal protoplaster från fruktmassa för användning i forskningsstudier. Tillämpligheten av denna metod är inte begränsad till “Fuji”. Protoplasterna i äppelmassan “Dounan” och “Honey Crisp” kan också extraheras genom samma protokoll (kompletterande figur S4). Protoplastlösningen efter enzymolys innehåller cel…

Materials

10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.