Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos
Summary
Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.
Abstract
Embora o fígado seja atualmente aceito como o principal local de transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos, as ilhotas são transplantadas sob a cápsula renal na maioria dos estudos de transplante de ilhotas pré-clínicas de roedores. Este modelo é comumente usado porque o transplante de ilhotas intrahpáticas de murina é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangrando do local de injeção pós-transplante. Neste estudo, são demonstrados dois procedimentos que podem minimizar a incidência de sangramento venoso do portal pós-infusão. O primeiro método aplica uma esponja de gelatina hemostática absorvível no local da injeção, e o segundo método envolve penetrar a agulha de injeção de ilhotas através do tecido adiposo primeiro e depois na veia portal usando o tecido adiposo como uma barreira física para parar o sangramento. Ambos os métodos poderiam efetivamente prevenir a morte do rato induzido pelo sangramento. Toda a seção hepática que mostra distribuição de ilhotas e evidências de trombose de ilhotas pós-transplante, característica típica do transplante de ilhotas intrahpáticas, foram apresentadas. Esses protocolos aprimorados refinam os procedimentos de transplante de ilhotas intrahpáticas e podem ajudar os laboratórios a configurar o procedimento para estudar a sobrevida de ilhotas e funcionar em ambientes pré-clínicos.
Introduction
O transplante de ilhotas intraportais (IIT) através da veia portal é o método mais utilizado para transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos. O modelo de IIT do camundongo oferece uma grande oportunidade de estudar transplante de ilhotas e testar abordagens intervencionistas promissoras que podem aumentar a eficácia do transplante de ilhotas1. O IIT foi descrito pela primeira vez na década de 1970 e usado por vários grupos1,2,3,4,5. Recuperou popularidade após o avanço no transplante de ilhotas humanas no ano de 20006,7. No entanto, a maioria dos estudos de transplante de ilhotas usou a cápsula renal como local preferido para transplante experimental de ilhotas devido ao seu fácil sucesso. Pelo contrário, o IIT é mais desafiador tecnicamente e menos frequentemente utilizado para estudos de transplante de ilhotas8,9. Ao contrário do IIT, no entanto, as ilhotas transplantadas sob a cápsula renal não sofrem da reação inflamatória mediada pelo sangue imediata caracterizada por trombose, inflamação e isquemia de tecido hepático, e, portanto, têm melhor função do que as ilhotas transplantadas no fígado. O modelo de cápsula renal, portanto, não pode imitar totalmente as tensões encontradas pelas ilhotas no transplante de ilhotas humanas10,11,12.
Uma das principais complicações do IIT em camundongos é o sangramento do local da injeção após o transplante, o que poderia causar 10-30% de mortalidade entre diferentes cepas de camundongos12. Neste artigo, duas abordagens refinadas foram desenvolvidas para parar o sangramento de forma mais rápida e segura e reduzir a mortalidade de camundongos após uma IIT. A demonstração visual desses detalhes refinados ajudará os pesquisadores a identificar os principais passos deste procedimento tecnicamente desafiador. Além disso, a localização dos enxertos de ilhotas no fígado do receptor foi determinada por exame histológico da Hematoxilina e Eosin (H&E) com ilhotas transplantadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, dois procedimentos aprimorados que podem prevenir sangramento e reduzir a mortalidade do rato durante o IIT do camundongo foram demonstrados. Este estudo permite que os pesquisadores visualizem o modelo de transplante de ilhotas que é único no estudo da resposta inflamatória mediada pelo sangue instantâneo após o transplante. O modelo IIT é um modelo distinto para estudar a sobrevivência das células ilhotas e lesões isquêmicas hepáticas em resposta ao transplante de ilhotas19</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (VA-ORD BLR&D Mérito I01BX004536), e pelo Instituto Nacional de Saúde concede # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, à HW. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Michael Lee e à Sra. Lindsay Swaby pela edição de linguagem
Materials
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
- Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
- Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
- Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
- Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
- Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
- Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
- Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
- Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
- Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
- Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
- Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
- Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993 (2018).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).
