Opname van fluorescerende gelabelde kleine extracellulaire blaasjes in vitro en in het ruggenmerg
Summary
We beschrijven een protocol om van macrofagen afgeleide kleine extracellulaire blaasjes te labelen met PKH-kleurstoffen en hun opname in vitro en in het ruggenmerg na intrathecale toediening te observeren.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) zijn 50-150 nm blaasjes die door alle cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in lichaamsvloeistoffen. sEV’s dragen biomoleculen zoals RNA, eiwitten en lipiden over van donor- naar acceptorcellen, waardoor ze belangrijke signaalmediatoren tussen cellen zijn. In het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen sEV’s intercellulaire signalering bemiddelen, inclusief neuro-immuuninteracties. sEV-functies kunnen worden bestudeerd door de opname van gelabelde sEV’s in ontvangende cellen zowel in vitro als in vivo tevolgen. Dit artikel beschrijft de etikettering van sEV’s uit de geconditioneerde media van RAW 264.7 macrofaagcellen met behulp van een PKH-membraankleurstof. Het toont de opname van verschillende concentraties van gelabelde sEV’s op meerdere tijdstippen door Neuro-2a-cellen en primaire astrocyten in vitro. Ook wordt de opname van sEV’s getoond die intrathecaal worden afgeleverd in neuronen van het ruggenmerg van muizen, astrocyten en microglia gevisualiseerd door confocale microscopie. De representatieve resultaten tonen tijdsafhankelijke variatie in de opname van sEV’s door verschillende cellen, wat kan helpen bij het bevestigen van succesvolle levering van sEV’s in het ruggenmerg.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s) zijn nanosized, van membraan afgeleide blaasjes met een groottebereik van 50-150 nm. Ze zijn afkomstig van multi-vesiculaire lichamen (MVP’s) en komen vrij uit cellen bij fusie van de MVP’s met het plasmamembraan. sEV’s bevatten miRNA’s, mRNA’s, eiwitten en bioactieve lipiden, en deze moleculen worden overgedragen tussen cellen in de vorm van cel-naar-cel communicatie. sEV’s kunnen worden geïnternaliseerd door ontvangende cellen door een verscheidenheid aan endocytische routes, en deze vangst van sEV’s door ontvangende cellen wordt gemedieerd door de herkenning van oppervlaktemoleculen op zowel EV’s als de doelcellen1.
sEV’s hebben belangstelling gekregen vanwege hun vermogen om moleculaire en fenotypische veranderingen in acceptorcellen te veroorzaken, hun nut als therapeutisch middel en hun potentieel als dragers voor vrachtmoleculen of farmacologische agentia. Vanwege hun kleine formaat kan het afbeelden en volgen van sEV’s een uitdaging zijn, vooral voor in vivo studies en klinische omgevingen. Daarom zijn er veel methoden ontwikkeld om sEV’s te labelen en inbeeld te brengen om hun biodistributie en tracking in vitro en in vivo te ondersteunen2.
De meest voorkomende techniek om sEV-biodistributie en doelcelinteracties te bestuderen, omvat het labelen ervan met fluorescerende kleurstofmoleculen3,4,5,6,7. EV’s werden aanvankelijk gelabeld met celmembraankleurstoffen die vaak werden gebruikt om cellen in beeld te brengen. Deze fluorescerende kleurstoffen kleuren over het algemeen de lipide dubbellaag of eiwitten van belang op sEV’s. Verschillende lipofiele kleurstoffen vertonen een sterk fluorescerend signaal wanneer ze in het cytosol worden opgenomen, waaronder DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninejodide), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanineperchloraat) en DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine 4-chloorbenzenesulfonaatzout)8,9,10,11.
Andere lipofiele kleurstoffen, zoals PKH67 en PKH26, hebben een zeer fluorescerende polaire kopgroep en een lange alifatische koolwaterstofstaart die gemakkelijk intercaleert in elke lipidestructuur en leidt tot langdurige kleurstofretentie en stabiele fluorescentie12. PKH-kleurstoffen kunnen ook EV’s labelen, waardoor ev-eigenschappen in vivo kunnen wordenbestudeerd13. Veel andere kleurstoffen zijn gebruikt om exosomen te observeren met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie, waaronder lipide-labelende kleurstoffen14 en celdoorlatende kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 en calceïne acetoxymethyl (AM) ester17.
Studies van sEV-gemedieerde kruisverwijzing tussen verschillende cellen in het CZS hebben belangrijke inzichten opgeleverd over de pathogenese van neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten18. SEV’s van neuronen kunnen bijvoorbeeld bèta-amyloïde peptiden en gefosforyleerde tau-eiwitten verspreiden en helpen bij de pathogenese van de ziekte van Alzheimer19. Bovendien bevatten EV’s afgeleid van erytrocyten grote hoeveelheden alfa-synucleïne en kunnen ze de bloed-hersenbarrière passeren en bijdragen aan de pathologie van Parkinson20. Het vermogen van sEV’s om fysiologische barrières21 te overschrijden en hun biomoleculen over te brengen naar doelcellen maakt ze handige hulpmiddelen om therapeutische geneesmiddelen aan het CZS te leveren22.
Het visualiseren van sEV-opname door talloze CZS-cellen in het ruggenmerg zal zowel mechanistische studies als de evaluatie van de therapeutische voordelen van exogene toegediende sEV’s uit verschillende cellulaire bronnen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft de methodologie om sEV’s afgeleid van macrofagen te labelen en hun opname in vitro en in vivo in het lumbale ruggenmerg door neuronen, microglia en astrocyten in beeld te brengen om de sEV-levering door visualisatie kwalitatief te bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol toonden we de etikettering van sEV’s met PKH-kleurstoffen en de visualisatie van hun opname in het ruggenmerg. PKH lipofiele fluorescerende kleurstoffen worden veel gebruikt voor het labelen van cellen door flowcytometrie en fluorescerende microscopie3,5,6,12,24,25. Vanwege hun relatief lange halfwaardetijd en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van NIH NINDS R01NS102836 en het Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) toegekend aan Seena K. Ajit. We bedanken Dr. Bradley Nash voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
