Upptag av fluorescerande märkta små extracellulära vesiklar in vitro och i ryggmärgen
Summary
Vi beskriver ett protokoll för att märka macrophage-härledda små extracellulära vesiklar med PKH färgämnen och observera deras upptag in vitro och i ryggmärgen efter intratekal leverans.
Abstract
Små extracellulära blåsor (sEVs) är 50-150 nm blåsor utsöndras av alla celler och finns i kroppsvätskor. sEVs överför biomolekyler som RNA, proteiner och lipider från givare till acceptorceller, vilket gör dem till viktiga signalmedlare mellan celler. I centrala nervsystemet (CNS) kan sEVs förmedla intercellulär signalering, inklusive neuroimmuna interaktioner. sEV-funktioner kan studeras genom att spåra användningen av märkta sEVs i mottagarceller både in vitro och in vivo. Detta dokument beskriver märkning av sEVs från konditionerade medier av RAW 264.7 makrofag celler med hjälp av en PKH membran färgämne. Det visar upptaget av olika koncentrationer av märkta sEVs vid flera tidpunkter av Neuro-2a celler och primära astrocyter in vitro. Också visas upptaget av sEVs levereras intratekalt i mus ryggmärg nervceller, astrocyter och microglia visualiseras av confocal mikroskopi. De representativa resultaten visar tidsberoende variation i upptaget av sEVs av olika celler, vilket kan bidra till att bekräfta framgångsrik sEVs leverans i ryggmärgen.
Introduction
Små extracellulära blåsor (sEVs) är nanosized, membran-härledda blåsor med ett storleksintervall på 50-150 nm. De kommer från multi-vesicular organ (MVBs) och frigörs från celler vid fusion av MVBs med plasmamembranet. SEVs innehåller miRNAs, mRNAs, proteiner och bioaktiva lipider, och dessa molekyler överförs mellan celler i form av cell-till-cell kommunikation. SEVs kan internaliseras av mottagarceller genom en mängd olika endocytiska vägar, och denna fångst av sEVs av mottagarceller förmedlas genom igenkänning av ytmolekyler på både EVs ochmålcellerna 1.
sEVs har fått intresse på grund av deras förmåga att utlösa molekylära och fenotypiska förändringar i acceptorceller, deras användbarhet som terapeutiskt medel och deras potential som bärare för lastmolekyler eller farmakologiska medel. På grund av deras lilla storlek kan avbildning och spårning av sEVs vara utmanande, särskilt för in vivo-studier och kliniska inställningar. Därför har många metoder utvecklats för att märka och avbilda sEVs för att hjälpa deras biodistribution och spårning in vitro och in vivo2.
Den vanligaste tekniken för att studera sEV biodistribution och mål cell interaktioner innebär att märka dem med fluorescerande färgämnenmolekyler 3,4,5,6,7. EVs var ursprungligen märkta med cellmembranfärger som ofta användes för att avbilda celler. Dessa fluorescerande färgämnen färgar i allmänhet lipid gallayer eller proteiner av intresse på sEVs. Flera lipofila färgämnen uppvisar en stark fluorescerande signal när de ingår i cytosolen, inklusive DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninjodid), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyaninperklorat) och DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyanin 4-klorobenzenesulfonatsalt)8,9,10,11.
Andra lipofila färgämnen, såsom PKH67 och PKH26, har en mycket fluorescerande polarhuvudgrupp och en lång alifatisk kolvätesvans som lätt intercalates i någon lipidstruktur och leder till långsiktig färgretention och stabil fluorescens12. PKH-färgämnen kan också märka EVs, vilket gör det möjligt att studera EV-egenskaper in vivo13. Många andra färgämnen har använts för att observera exosomer med fluorescensmikroskopi och flödescytometri, inklusive lipidmärkningsfärgämnen14 och cellgenomsläppliga färgämnen som karboxyfluoresceindiaktat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 och calcein acetoxymethyl (AM) ester17.
Studier av sEV-medierad crosstalk mellan olika celler i CNS har gett viktiga insikter om patogenesen vid neuroinflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar18. Till exempel kan sEVs från nervceller sprida beta-amyloidpeptider och fosforylerade tau-proteiner och hjälpa till med patogenesen vid Alzheimers sjukdom19. Dessutom innehåller EVs som härrör från erytrocyter stora mängder alfa-synuklein och kan korsa blod – hjärnbarriären och bidra till Parkinsons patologi20. SEVs förmåga att korsa fysiologiskahinder 21 och överföra sina biomolekyler till målceller gör dem till praktiska verktyg för att leverera terapeutiska läkemedel till CNS22.
Visualisera sEV upptag av otaliga CNS celler i ryggmärgen kommer att möjliggöra både mekanistiska studier och utvärdering av de terapeutiska fördelarna med exogent administrerade sEVs från olika cellulära källor. Detta dokument beskriver metoden att märka sEVs härrör från makrofager och avbilda deras upptag in vitro och in vivo i ländryggen ryggmärgen av nervceller, microglia och astrocyter att kvalitativt bekräfta sEV leverans genom visualisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll visade vi märkning av sEVs med PKH färgämnen och visualisering av deras upptag i ryggmärgen. PKH lipofila fluorescerande färgämnen används ofta för att märka celler efter flödescytometri och fluorescerande mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grund av deras relativt långa halveringstid och låga cytotoxi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från NIH NINDS R01NS102836 och Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) som tilldelats Seena K. Ajit. Vi tackar dr Bradley Nash för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
