Summary

Vitro ve Omurilikte Floresan Etiketli Küçük Hücre Dışı Veziklin Alımı

Published: May 23, 2021
doi:

Summary

Makrofajdan türetilmiş küçük hücre dışı vesikleleri PKH boyalarla etiketlemek ve intratekal doğumdan sonra in vitro ve omurilikte alımlarını gözlemlemek için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV’ ler) tüm hücreler tarafından salgılanan ve vücut sıvılarında bulunan 50-150 nm veziklinlerdir. SEV’ler RNA, proteinler ve lipitler gibi biyomolekülleri donörden alıcı hücrelere aktararak hücreler arasında anahtar sinyal verici arabulucular haline getirir. Merkezi sinir sisteminde (CNS), sEV’ler nöroimmün etkileşimler de dahil olmak üzere hücreler arası sinyalizasyona aracılık edebilir. sEV fonksiyonları, alıcı hücrelerde hem in vitro hem de in vivoolarak etiketli sEV’lerin alımını izleyerek incelenebilir. Bu makalede, RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin koşullandırılmış ortamlarından SEV’lerin PKH membran boyası kullanılarak etiketlenerek etiketlenimi açıklanmaktadır. Nöro-2a hücreleri ve birincil astrosit in vitro tarafından birden fazla zaman noktasında etiketli sEV’lerinfarklı konsantrasyonlarının alımını gösterir. Ayrıca fare omurilik nöronlarında, astrositlerde ve konfokal mikroskopi ile görselleştirilen mikroglialarda intratekal olarak teslim edilen sEV’lerin alımı gösterilmiştir. Temsili sonuçlar, sEV’lerin farklı hücreler tarafından alınmasında zamana bağlı varyasyonu göstermektedir, bu da omuriliğe başarılı sEV’lerin teslimini doğrulamaya yardımcı olabilir.

Introduction

Küçük hücre dışı veziklinler (sEV’ler) 50-150 nm boyut aralığına sahip nanosized, membran türevi veziklinlerdir. Çok araçlı cisimlerden (MVB’ ler) kaynaklanırlar ve MVB’lerin plazma zarı ile füzyonu üzerine hücrelerden salınırlar. sEV’ler miRNA’lar, mRNA’lar, proteinler ve biyoaktif lipitler içerir ve bu moleküller hücreler arasında hücreden hücreye iletişim şeklinde aktarılır. sEV’ler alıcı hücreler tarafından çeşitli endosit yollar tarafından içselleştirilebilir ve sEV’lerin alıcı hücreler tarafından bu şekilde yakalanması, hem EV’lerdeki hem de hedef hücrelerdeki yüzey moleküllerinin tanınması ile aracılık eder1.

SEV’ler, kabul eden hücrelerde moleküler ve fenotipik değişiklikleri tetikleme kapasiteleri, terapötik bir ajan olarak yararları ve kargo molekülleri veya farmakolojik ajanlar için taşıyıcı olarak potansiyelleri nedeniyle ilgi kazanmıştır. Küçük boyutları nedeniyle, sEV’lerin görüntülenmesi ve izlenmesi, özellikle in vivo çalışmalar ve klinik ayarlar için zor olabilir. Bu nedenle, biyodistribution ve in vitro ve in vivo 2 izlemelerine yardımcı olmak için sEV’leri etiketlemek ve görüntülemek için birçok yöntem geliştirilmiştir.

SEV biyodistribasyon ve hedef hücre etkileşimlerini incelemek için en yaygın teknik, floresan boya molekülleri 3 , 4,5,6,7ile etiketlemeyi içerir. EV’ler başlangıçta hücreleri görüntülemde yaygın olarak kullanılan hücre zarı boyaları ile etiketlenmiştir. Bu floresan boyalar genellikle lipid bilayer veya sEV’lerde ilgi çekici proteinleri lekeler. Birkaç lipofilik boyalar, DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′,-tetrametindotricarbocyanine iyodür), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3), dahil olmak üzere sitozol içine dahil edildiğinde güçlü bir floresan sinyal gösterir. 3, 3′, 3′-tetrametrin indokarboksiyanine perklorat), ve DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametil indokarboksiyanin 4-klorobenzenesulfonat tuzu)8,9,10,11.

PKH67 ve PKH26 gibi diğer lipofilik boyalar, son derece floresan bir polar kafa grubuna ve herhangi bir lipit yapısına kolayca karışan ve uzun süreli boya tutma ve stabil floresan12’yeyol açan uzun bir alifatik hidrokarbon kuyruğuna sahiptir. PKH boyaları, VIVO13’tekiEV özelliklerinin incelenmesine izin veren EV’leri deetiketleyebilir. Floresan mikroskopi ve akış sitometrisi kullanarak ekzomları gözlemlemek için başka birçok boya kullanılmıştır, lipid etiketleme boyaları14 ve karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA-SE)15,16 ve calcein asetoksimetil (AM) ester17gibi hücre geçirgen boyalar dahil.

CNS’deki farklı hücreler arasında sEV aracılı çapraz konuşma çalışmaları nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezine dair önemli içgörüler sağlamıştır18. Örneğin, nöronlardan gelen SEV’ler beta-amiloid peptitleri ve fosforillenmiş tau proteinlerini yayabilir ve Alzheimer hastalığının patogenezine yardımcı olabilir19. Ek olarak, eritrositlerden elde edilen EV’ler büyük miktarlarda alfa-sinüklein içerir ve kan-beyin bariyerini geçebilir ve Parkinson patolojisine katkıda bulunabilir20. SEV’lerin fizyolojik engelleri21’i geçebilmeleri ve biyomoleküllerini hedef hücrelere aktarabilmeleri, onları CNS22’yeterapötik ilaçlar sunmak için uygun araçlar haline getirir.

SEV alımını omurilikteki sayısız CNS hücresi tarafından görselleştirmek, hem mekanistik çalışmalara hem de çeşitli hücresel kaynaklardan eksojen olarak uygulanan SEV’lerin terapötik faydalarının değerlendirilmesini sağlayacaktır. Bu makalede, makrofajlardan elde edilen sEV’leri etiketlemek ve lomber omurilikteki in vitro ve in vivo alımlarını nöronlar, mikroglia ve astrositler tarafından görselleştirme ile sEV doğumunu niteliksel olarak doğrulamak için etiketlemek için metodoloji açıklanmaktadır.

Protocol

NOT: Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu’na uygun olarak gerçeklatılmış ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zamanlanmış hamile CD-1 fareler astrositik kültür için kullanıldı ve tüm barajlar emprenye edildikten 15 gün sonra alındı. In vivo alım deneyleri için 10-12 haftalık C57BL/6 fareler kullanıldı. 1. SEV’lerin RAW 264.7 makrofaj hüc…

Representative Results

SEV’lerin RAW 264.7 şartlandırılmış ortamdan santrifüjleme yoluyla izole edilmesi sonrasında, saflaştırılmış SEV’lerin konsantrasyonunu ve boyut dağılımını belirlemek için NTA kullanılmıştır. RAW 264.7 türevi sEV’lerin ortalama ortalama büyüklüğü 140 nm ve tepe parçacık boyutu 121.8 nm idi ve ışık saçılma ölçümündeki çoğu tespit edilebilir parçacığın 50-150 nm’de ekzozom veya sEV boyut aralığına düştüğünü doğruladı (Şekil 1A). Hücre d…

Discussion

Bu protokolde SEV’lerin PKH boyalarla etiketlenmesi ve omurilikteki alımlarının görselleştirilmesini gösterdik. PKH lipofilik floresan boyalar, akış sitometrisi ve floresan mikroskopi 3 , 5 ,6,12,24,25ile hücreleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nispeten uzun yarı ömürleri ve düşük sitotok…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH NINDS R01NS102836 ve Seena K. Ajit’e verilen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme (CURE) hibeleri ile desteklenmiştir. Dr. Bradley Nash’e makaleyi eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz.

Materials

Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters MilliporeSigma Z677094
Anti-Alix Antibody Abcam ab186429 1:1000
Anti-Calnexin Antibody Abcam Ab10286 1:1000
Anti-CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-166029 1:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) Cell Signaling Technology 2118 1:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Sigma-Aldrich MAB360 1:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 Antibody Wako 019-19741 1:2000
Anti-MAP2A Antibody Sigma-Aldrich MAB378 1:500
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332
Cell Strainer, 40 μm VWR 15-1040-1
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3118-0050 12,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72222-01
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG 1 µg/mL
DC Protein Assay Bio-Rad 500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I) MilliporeSigma D4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcam ab16284 1:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21206 1:500
Double Frosted Microscope Slides, #1 Thermo Scientific 12-552-5
DPBS without Calcium and Magnesium Corning 21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Gibco A27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
FluorChem M imaging system ProteinSimple
FV3000 Confocal Microscope Olympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) Abcam ab6789 1:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 1:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) VWR 02-0121
HEPES Gibco 15630080
HRP Substrate Thermo Scientific 34094
Intercept blocking buffer, TBS LI-COR Biosciences 927-60001
Laemmli SDS Sample Buffer Alfa Aesar AAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1 VWR 48404-454
Microm HM550 Thermo Scientific
NanoSight NS300 system Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 software Malvern Panalytical
Neuro-2a Cell Line ATCC CCL-131
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
O.C.T Compound Sakura Finetek 4583
Papain Worthington Biochemical Corporation NC9597281
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PKH26 Sigma-Aldrich MINI26-1KT
PKH67 Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 1862209
PVDF Transfer Membrane MDI SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell Line ATCC TIB-71
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Sodium Chloride AMRESCO 0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold Slides Thermo Scientific 15-188-48 adhesive slides
T-75 Flasks Corning 431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope FEI Company
TEM Grids Electron Microscopy Sciences FSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12% Invitrogen XP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC26755
Tris-Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
TrypLE Express cell dissociation enzyme
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Trypsin, 0.25% Corning 25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge Tubes Beckman 344058 110,000 x g

References

  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
  5. Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
check_url/kr/62537?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Gupta, R., Luo, X., Lin, Z., Tian, Y., Ajit, S. K. Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord. J. Vis. Exp. (171), e62537, doi:10.3791/62537 (2021).

View Video