एक अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ एक मुरीन मॉडल में अग्न्याशय के वीवो सेलुलर-स्तर दृश्य में स्थिर देशांतर
Summary
विवो में अग्न्याशय की उच्च-संकल्प इमेजिंग अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के साथ सुविधा प्रदान की गई थी।
Abstract
एक जीवित छोटे पशु मॉडल में अग्न्याशय के वीवो सेलुलर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में प्रत्यक्ष तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। पेट इमेजिंग विंडो के साथ हाल ही में इंट्राविटल इमेजिंग अध्ययन, वीवोमें पेट के अंगों में सेलुलर गतिशीलता के दृश्य को सक्षम करता है। हालांकि, माउस अग्न्याशय की नरम शीट जैसी वास्तुकला के कारण जो आसानी से फिजियोलॉजिकल आंदोलन (जैसे, परिस्टलसिस और श्वसन) से प्रभावित हो सकता है, माउस पैंक्रियाज में आइलेट्स या कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने, ट्रैक करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सेलुलर स्तर पर कई हफ्तों में वीवो इमेजिंग में स्थिर देशांतर करना मुश्किल था। इसके साथ ही, हम एक उपन्यास सहायक आधार, एक एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो को प्रत्यारोपित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, जो अग्न्याशय माइक्रोस्ट्रक्चर के देशांतर समय-चूक इंट्राविटल इमेजिंग के लिए आंत्र से अग्न्याशय को अलग कर सकता है। इमेजिंग विंडो के साथ वीवो इमेजिंग में देशांतर स्थिर दृश्य को सक्षम बनाता है, जो 3 सप्ताह की अवधि में आइलेट्स की ट्रैकिंग और माइक्रोस्ट्रक्चर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जैसा कि यहां ऑर्थोटोपिक अग्नाशय के कैंसर मॉडल में सबूत है। हमारी विधि के साथ, आगे इंट्राविटल इमेजिंग अध्ययन सेलुलर स्तर पर अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के रोगविज्ञान को स्पष्ट कर सकते हैं।
Introduction
अग्न्याशय पाचन तंत्र में एक एक्सोक्राइन समारोह और खून में हार्मोन स्राव के एक अंतःस्रावी समारोह के साथ एक पेट अंग है। अग्न्याशय के उच्च संकल्प सेलुलर इमेजिंग अग्न्याशय, अग्नाशय के कैंसर, और मधुमेह मेलिटस1सहित अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के रोगविज्ञान प्रकट कर सकता है । पारंपरिक नैदानिक इमेजिंग उपकरण जैसे गणना टोमोग्राफी, चुंबकीय संकल्प इमेजिंग, और अल्ट्रासोनोग्राफी नैदानिक क्षेत्र में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं1,2। हालांकि, ये इमेजिंग तौर-तरीके केवल संरचनात्मक या शारीरिक परिवर्तनों की कल्पना करने तक सीमित हैं, जबकि सेलुलर या आणविक स्तर पर परिवर्तन निर्धारित नहीं किए जा सकते हैं । यह देखते हुए कि मनुष्यों में मधुमेह मेलिटस या अग्नाशय के कैंसर में आणविक परिवर्तन निदान3,4 से पहले 10 साल से अधिक शुरू कर सकते हैं, अव्यक्त अवधि केदौरानउनके आणविक संक्रमण से अग्नाशय के रोगों का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक निदान और एक समय पर हस्तक्षेप प्रदान करने की क्षमता है । इस प्रकार, इमेजिंग जो संकल्प की सीमाओं को दूर करेगा और कार्य में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, अग्नाशय के कैंसर का शीघ्र निदान या मधुमेह की प्रगति के दौरान आइलेट्स के परिवर्तन की उन्नत पहचान प्रदान करके उल्लेखनीय रूप से ध्यान प्राप्त करेगा5।
विशेष रूप से आइलेट्स के साथ, न्यूक्लियर इमेजिंग, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग, और ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी को गैर-इनवेसिव आइलेट इमेजिंग तकनीक6के रूप में सुझाया गया है। हालांकि, इन तरीकों का संकल्प काफी कम है, जिसमें कई दसियों से लेकर सैकड़ों माइक्रोमीटर तक के विशिष्ट मूल्य हैं, जो आइलेट्स में सेलुलर स्तर पर परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक सीमित क्षमता प्रदान करते हैं। दूसरी ओर, पूर्व वीवो7, 8(उदाहरण केलिए, आइलेट्स के पिछले उच्च-संकल्प अध्ययन किए गए थे। अग्न्याशय का टुकड़ा या पाचन), गैर-फिजियोलॉजिकल9 (उदाहरण के लिए, अग्न्याशय का बाहरीकरण), और हेट्रोटोपिक स्थितियां10,11,12 (उदाहरण के लिए, गुर्दे कैप्सूल के नीचे प्रत्यारोपण, जिगर के अंदर, और आंख के पूर्वकाल कक्ष में), जो उनकी व्याख्या और नैदानिक प्रभावों को प्रतिबंधित करता है। यदि वीवो में,फिजियोलॉजिक, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के ऑर्थोटोपिक मॉडल की स्थापना की जा सकती है, तो यह अग्नाशय के आइलेट्स की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण मंच होगा।
इंट्राविटल इमेजिंग, जो एक जीवित जानवर में एक सूक्ष्म संकल्प स्तर पर रोगविज्ञान का पता चलता है, हाल ही में महान ध्यान13प्राप्त हुआ है । वीवो इमेजिंग विधियों में से, एक पेट इमेजिंग विंडो14के विकास, जो माउस के पेट में एक खिड़की प्रत्यारोपित करता है, ने उपन्यास निष्कर्षों की खोज की अनुमति दी है (यानी, प्रारंभिक यकृत मेटास्टेसिस15 का एक पूर्व-माइक्रोमेटास्टेसिस चरण और आंतों के एपिथेलियम16में स्टेम सेल रखरखाव का तंत्र)। हालांकि पेट इमेजिंग खिड़की मूल्यवान परिणाम प्रदान करता है, अग्न्याशय के लिए इस खिड़की के अनुप्रयोगों और जिसके परिणामस्वरूप इंट्राविटल इमेजिंग अग्न्याशय से जुड़े रोगों के आधार पर अनुसंधान, बड़े पैमाने पर जांच नहीं की गई है ।
मानव अग्न्याशय की अच्छी तरह से परिभाषित ठोस अंग विशेषताओं के विपरीत, माउस का अग्न्याशय एक फैलाव वितरित नरम ऊतक जैसी संरचनाहै 17। इसलिए, यह लगातार परिध और श्वसन सहित शारीरिक आंदोलनों से प्रभावित होता है। अग्न्याशय के लिए एक पेट इमेजिंग खिड़की के आवेदन पर पिछले अध्ययन से पता चला है कि भटक गति के कारण हुआ-आंत्र आंदोलनों से प्रेरित कलाकृतियों18। परिणामस्वरूप औसत छवि में गंभीर धुंधला देखा गया, जिसने माइक्रोस्केल संरचनाओं के दृश्य और पहचान को बाधित किया।
इसके साथ, हम अग्न्याशय से जुड़े रोगों में देशांतर सेलुलर स्तर की घटनाओं की जांच करने के लिए इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी19,20 के साथ संयुक्त आधार एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का समर्थन करने वाले उपन्यास के उपयोग का वर्णन करते हैं। पिछले अध्ययन18में कार्यप्रणाली का विस्तृत विवरण के अलावा, अग्न्याशय से जुड़े विभिन्न रोगों के लिए अग्नाशय इमेजिंग विंडो के विस्तारित आवेदन को इस पेपर में संबोधित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल में, एक कस्टम-निर्मित वीडियो-रेट लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी सिस्टम के रूप में किया गया था। चार लेजर मॉड्यूल (405, 488, 561, और 640 एनएम पर तरंगदैर्ध्य) का उपयोग एक उत्तेजन स्रोत के रूप में किया गया था, और बैंडपास फिल्टर (बीपीएफ 1) के माध्यम से फोटोमुलिटैप्टल ट्यूब (पीएमटी) द्वारा उत्सर्जन संकेतों के चार चैनलों का पता लगाया गया था; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40) । लेजर स्कैनिंग में एक घूर्णन बहुभुज दर्पण (एक्स-एक्सिस) और एक गैलेवनोमीटर स्कैनिंग मिरर (वाई-एक्सिस) शामिल था जिसने वीडियो-दर स्कैनिंग (30 फ्रेम प्रति सेकंड) सक्षम किया। इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी के बारे में विस्तृत जानकारी पिछलेअध्ययनों में 10 , 18,19, 20,21,22,23केबारे में वर्णित की गई है .
हमारे पिछले आइलेट अध्ययन18में, हमने ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (एमआईपी-जीएफपी)24 का उपयोग करके लाइव चूहों में आइलेट्स को सफलतापूर्वक और स्थिर रूप से चित्रित किया जिसमें आइलेट्स को जीएफपी के साथ टैग किया गया था। विधि ने 1 सप्ताह की अवधि में आइलेट्स में परिवर्तनों के उच्च-संकल्प दृश्य को सक्षम किया। इसने 3 सप्ताह तक एक ही आइलेट्स की इमेजिंग की सुविधा भी प्रदान की, जो मधुमेहमेलिटस 18के रोगजनन के दौरान कार्यात्मक ट्रैकिंग या निगरानी के लिए अग्नाशय के आइलेट्स के दीर्घकालिक अध्ययनों की व्यवहार्यता का सुझाव देता है। इसके अलावा, हमने एक आर्थोटोपिक अग्नाशय का कैंसर मॉडल विकसित किया जिसमें फ्लोरोसेंट अग्नाशय की कैंसर कोशिकाएं (पैनी-1 न्यूलाइट रेड)25 को सीधे माउस के अग्न्याशय में प्रत्यारोपित किया गया था। अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो के आवेदन के साथ, इस मॉडल को अग्नाशय के कैंसर के ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में सेलुलर और आणविक रोगविज्ञान की जांच करने और उपन्यास दवा उम्मीदवारों की चिकित्सीय निगरानी के लिए एक मंच के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एक उपन्यास का समर्थन करने वाले आधार एकीकृत अग्नाशय इंट्राविटल इमेजिंग विंडो का उपयोग करके अग्न्याशय की इंट्राविटल इमेजिंग शामिल है जो पेट इमेजिंग विंडो से संशोधित है। ऊपर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को स्नूथ रिसर्च फंड से अनुदान संख्या 14-2020-002 और कोरिया सरकार (MSIT) (एनआरएफ-2020R1F1A1A1058381, एनआरएफ-2020R1A2C3005694) द्वारा वित्त पोषित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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