Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster
Summary
In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.
Abstract
Die direkte in vivo zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in einem lebenden Kleintiermodell war technisch anspruchsvoll. Eine kürzlich durchgeführte intravitale Bildgebungsstudie mit einem abdominalen Bildgebungsfenster ermöglichte die Visualisierung der zellulären Dynamik in Bauchorganen in vivo. Aufgrund der weichen blattartigen Architektur der Bauchspeicheldrüse der Maus, die leicht durch physiologische Bewegungen (z. B. Peristaltik und Atmung) beeinflusst werden kann, war es jedoch schwierig, eine stabilisierte longitudinale In-vivo-Bildgebung über mehrere Wochen auf zellulärer Ebene durchzuführen, um Inselchen oder Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse der Maus zu identifizieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Hierin beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer neuartigen Stützbasis, einem integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfenster, das die Bauchspeicheldrüse räumlich vom Darm trennen kann, um die intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse in Längsschnitt zu drehen. Die longitudinale In-vivo-Bildgebung mit dem Bildgebungsfenster ermöglicht eine stabile Visualisierung, die die Verfolgung von Inseln über einen Zeitraum von 3 Wochen und eine hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Mikrostruktur ermöglicht, wie hier in einem orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell gezeigt. Mit unserer Methode können weitere intravitalen bildgebenden Untersuchungen die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene aufklären.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse ist ein Bauchorgan mit einer exokrinen Funktion im Verdauungstrakt und einer endokrinen Funktion, Hormone in den Blutkreislauf zu sezernieren. Hochauflösende zelluläre Bildgebung der Bauchspeicheldrüse könnte die Pathophysiologie verschiedener Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse aufdecken, darunter Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Diabetes mellitus1. Herkömmliche diagnostische Bildgebungswerkzeuge wie Computertomographie, Bildgebung mit magnetischer Auflösung und Ultraschall sind im klinischen Bereich weit verbreitet1,2. Diese Bildgebungsmodalitäten beschränken sich jedoch darauf, nur strukturelle oder anatomische Veränderungen zu visualisieren, während Veränderungen auf zellulärer oder molekularer Ebene nicht bestimmt werden können. Da molekulare Veränderungen bei Diabetes mellitus oder Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen mehr als 10 Jahre vor der Diagnose3,4beginnenkönnen,hat die Erkennung von Pankreaserkrankungen aus ihrem molekularen Übergang während der Latenzzeit das Potenzial, eine frühzeitige Diagnose und eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. So wird eine Bildgebung, die die Einschränkungen der Auflösung überwindet und wertvolle Einblicke in die Funktion liefert, bemerkenswert aufmerksamkeitserregen, indem sie eine frühzeitige Diagnose von Bauchspeicheldrüsenkrebs oder eine fortgeschrittene Identifizierung der Veränderung der Inseln während des Fortschreitens von Diabetes mellitus5ermöglicht.
Insbesondere bei den Inseln wurden die nukleare Bildgebung, die Biolumineszenzbildgebung und die optische Kohärenztomographie als nicht-invasive Inselbildgebungsverfahren vorgeschlagen6. Die Auflösung dieser Methoden ist jedoch im Wesentlichen niedrig, mit typischen Werten von mehreren zehn bis hunderten Mikrometern, die eine begrenzte Fähigkeit bieten, Veränderungen auf zellulärer Ebene in den Inseln zu erkennen. Auf der anderen Seite wurden frühere hochauflösende Studien von Inseln unter ex vivo7,8 (z. B. Schneiden oder Verdauung der Bauchspeicheldrüse), nicht-physiologischen9 (z. B. Exteriorisierung der Bauchspeicheldrüse) und heterotopenZuständen 10,11,12 (z. B. Implantation unter der Nierenkapsel, in der Leber und in der vorderen Augenkammer) durchgeführt, was ihre Interpretation und klinischen Auswirkungen einschränkt. Wenn in vivoein physiologisches und orthotopisches Modell der hochauflösenden Bildgebung etabliert werden kann, wird es eine kritische Plattform für die Untersuchung von Pankreasinseln sein.
Die intravitale Bildgebung, die die Pathophysiologie bei einer mikroskopischen Auflösung bei einem lebenden Tier aufzeigen, hat kürzlich große Aufmerksamkeit erhalten13. Von den in vivo bildgebenden Verfahren hat die Entwicklung eines abdominalen Bildgebungsfensters14, das ein Fenster in den Bauch einer Maus implantiert, die Entdeckung neuer Erkenntnisse ermöglicht (d.h. ein Prä-Mikrometastasierungsstadium der frühen Lebermetastasierung15 und Mechanismus der Stammzellerhaltung im Darmepithel16). Obwohl das abdominale Bildgebungsfenster wertvolle Ergebnisse liefert, wurden die Anwendungen dieses Fensters für die Bauchspeicheldrüse und die daraus resultierende intravitale Bildgebungsforschung auf der Grundlage von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse nicht umfassend untersucht.
Im Gegensatz zu den gut definierten festen Organeigenschaften der menschlichen Bauchspeicheldrüse ist die Bauchspeicheldrüse einer Maus eine diffus verteilte weichteilartige Struktur17. Daher wird es unaufhörlich durch physiologische Bewegungen einschließlich Peristaltik und Atmung beeinflusst. Eine frühere Studie über die Anwendung eines abdominalen Bildgebungsfensters für die Bauchspeicheldrüse zeigte, dass das Wandern aufgrund von Bewegungsartefakten auftrat, die durch Stuhlgang induziert wurden18. Im resultierenden gemittelten Bild wurden starke Unschärfen beobachtet, die die Visualisierung und Identifizierung der mikroskaligen Strukturen behinderten.
Hierin beschreiben wir die Verwendung eines neuartigen unterstützenden basenintegrierten pankreasintevitalen intravitalen Bildgebungsfensters in Kombination mit der intravitalenMikroskopie 19,20, um die longitudinalen zellulären Ereignisse bei Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Neben einer detaillierten Beschreibung der Methodik in der vorangegangenen Studie18wird in diesem Beitrag die erweiterte Anwendung des Pankreas-Bildgebungsfensters für verschiedene Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse behandelt. In diesem Protokoll wurde ein speziell angefertigtes videorates Laser-Scanning-konfokale Mikroskopiesystem als intravitale Mikroskopiesystem verwendet. Vier Lasermodule (Wellenlängen bei 405, 488, 561 und 640 nm) wurden als Anregungsquelle verwendet, und vier Kanäle von Emissionssignalen wurden durch Photomultiplierröhren (PMT) durch Bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserscanning bestand aus einem rotierenden polygonalen Spiegel (X-Achse) und einem Galvanometer-Scanning-Spiegel (Y-Achse), der das Scannen der Videorate (30 Bilder pro Sekunde) ermöglichte. Detaillierte Informationen über die intravitalen Mikroskopie wurden in den vorherigen Studien10,18,19,20,21,22,23beschrieben.
In unserer vorherigen Inselstudie18haben wir die Inseln in lebenden Mäusen mit einem transgenen Mausmodell (MIP-GFP)24, in dem die Inseln mit GFP markiert wurden, erfolgreich und stabil abgebildet. Die Methode ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Veränderungen in den Inseln über einen Zeitraum von 1 Woche. Es erleichterte auch die Bildgebung der gleichen Inseln für bis zu 3 Wochen, was auf die Machbarkeit von Langzeitstudien der Pankreasinseln für die funktionelle Verfolgung oder Überwachung während der Pathogenese von Diabetes mellitus18hindeutet. Des Weiteren entwickelten wir ein orthotopes Bauchspeicheldrüsenkrebsmodell, bei dem fluoreszierende Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 NucLight Red)25 direkt in die Bauchspeicheldrüse der Maus implantiert wurden. Mit der Anwendung des pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters könnte dieses Modell als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Pathophysiologie in der Tumormikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs und zur therapeutischen Überwachung neuartiger Wirkstoffkandidaten genutzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll besteht aus der intravitalen Bildgebung der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung eines neuartigen unterstützenden integrierten pankreatischen intravitalen Bildgebungsfensters, das von einem abdominalen Bildgebungsfenster modifiziert wurde. Unter den oben beschriebenen Protokollen ist der erste kritische Schritt die Implantation des intravitalen Pankreas-Bildgebungsfensters in die Maus. Für das Auftragen des Klebstoffs im Fenster ist es wichtig, den Kleber zwischen dem Rand des Fensters u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch den Zuschuss Nr. 14-2020-002 des SNUBH Research Fund und durch den von der koreanischen Regierung (MSIT) finanzierten Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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