Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico
Summary
L’imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.
Abstract
L’imaging diretto in vivo a risoluzione cellulare del pancreas in un modello di piccolo animale vivo è stato tecnicamente impegnativo. Un recente studio di imaging intravitale, con una finestra di imaging addominale, ha permesso la visualizzazione delle dinamiche cellulari negli organi addominali in vivo. Tuttavia, a causa dell’architettura morbida del pancreas del topo che può essere facilmente influenzata dal movimento fisiologico (ad esempio, peristalsi e respirazione), è stato difficile eseguire l’imaging longitudinale in vivo stabilizzato per diverse settimane a livello cellulare per identificare, tracciare e quantificare isole o cellule tumorali nel pancreas del topo. Qui, descriviamo un metodo per impiantare una nuova base di supporto, una finestra di imaging intravitale pancreatica integrata, che può separare spazialmente il pancreas dall’intestino per l’imaging intravitale longitudinale time-lapse della microstruttura del pancreas. L’imaging longitudinale in vivo con la finestra di imaging consente una visualizzazione stabile, consentendo il tracciamento delle isole per un periodo di 3 settimane e l’imaging tridimensionale ad alta risoluzione della microstruttura, come evidenziato qui in un modello di cancro del pancreas ortotopico. Con il nostro metodo, ulteriori studi di imaging intravitale possono chiarire la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas a livello cellulare.
Introduction
Il pancreas è un organo addominale con una funzione esocrina nel tratto digestivo e una funzione endocrina di secernere ormoni nel flusso sanguigno. L’imaging cellulare ad alta risoluzione del pancreas potrebbe rivelare la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas, tra cui pancreatite, cancro del pancreas e diabete mellito1. Gli strumenti di diagnostica per immagini convenzionali come la tomografia computerizzata, l’imaging a risoluzione magnetica e l’ecografia sono ampiamente disponibili nel campo clinico1,2. Tuttavia, queste modalità di imaging sono limitate alla visualizzazione solo di cambiamenti strutturali o anatomici, mentre le alterazioni a livello cellulare o molecolare non possono essere determinate. Dato che i cambiamenti molecolari nel diabete mellito o nel cancro del pancreas nell’uomo possono iniziare più di 10 anni prima della diagnosi3,4, l’individuazione delle malattie pancreatiche dalla loro transizione molecolare durante il periodo latente ha il potenziale per fornire una diagnosi precoce e un intervento tempestivo. Pertanto, l’imaging che supererà i limiti della risoluzione e fornirà preziose informazioni sulla funzione guadagnerà notevolmente l’attenzione fornendo una diagnosi precoce del cancro del pancreas o l’identificazione avanzata dell’alterazione delle isole durante la progressione del diabete mellito5.
In particolare con le isole, l’imaging nucleare, l’imaging a bioluminescenza e la tomografia a coerenza ottica sono stati suggeriti come tecniche di imaging delle isole non invasive6. Tuttavia, la risoluzione di questi metodi è sostanzialmente bassa, con valori tipici che vanno da diverse decine a centinaia di micrometri, offrendo una capacità limitata di rilevare cambiamenti a livello cellulare negli isolotti. D’altra parte, precedenti studi ad alta risoluzione sulle isole sono stati eseguiti in condizioni ex vivo7,8 (ad esempio, affettamento o digestione del pancreas),9 non fisiologico (ad esempio, esteriorizzazione del pancreas) e condizioni eterotopiche10,11,12 (ad esempio, impianto sotto la capsula renale, all’interno del fegato e nella camera anteriore dell’occhio), che limita la loro interpretazione e le implicazioni cliniche. Se è possibile stabilire un modello in vivo,fisiologico e ortotopico di imaging ad alta risoluzione, sarà una piattaforma critica per lo studio delle isole pancreatiche.
L’imaging intravitale, che rivela la fisiopatologia a livello di risoluzione microscopica in un animale vivo, ha recentemente ricevuto grande attenzione13. Tra i metodi di imaging in vivo, lo sviluppo di una finestra di imaging addominale14, che impianta una finestra nell’addome di un topo, ha permesso la scoperta di nuovi risultati (cioè uno stadio di pre-micrometastasi delle metastasi epatiche precoci15 e meccanismo di mantenimento delle cellule staminali nell’epitelio intestinale16). Sebbene la finestra di imaging addominale fornisca risultati preziosi, le applicazioni di questa finestra per il pancreas e la conseguente ricerca di imaging intravitale basata su malattie che coinvolgono il pancreas, non sono state ampiamente studiate.
A differenza delle caratteristiche ben definite degli organi solidi del pancreas umano, il pancreas di un topo è una struttura simile ai tessuti molli diffusamente distribuita17. Pertanto, è incessantemente influenzato da movimenti fisiologici tra cui peristalsi e respirazione. Un precedente studio sull’applicazione di una finestra di imaging addominale per il pancreas ha dimostrato che il vagabondaggio si è verificato a causa di artefatti di movimento indotti da movimenti intestinali18. È stata osservata una grave sfocatura nell’immagine mediata risultante, che ha impedito la visualizzazione e l’identificazione delle strutture su microscala.
Qui, descriviamo l’uso di una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata di base di supporto combinata con la microscopia intravitale19,20 per indagare gli eventi di livello cellulare longitudinale nelle malattie che coinvolgono il pancreas. Oltre a una descrizione dettagliata della metodologia nel precedente studio18, l’applicazione estesa della finestra di imaging pancreatico per varie malattie che coinvolgono il pancreas sarà affrontata in questo documento. In questo protocollo, un sistema di microscopia confocale a scansione laser a velocità video personalizzato è stato utilizzato come sistema di microscopia intravitale. Quattro moduli laser (lunghezze d’onda a 405, 488, 561 e 640 nm) sono stati utilizzati come sorgente di eccitazione e quattro canali di segnali di emissione sono stati rilevati da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso filtri passa-banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). La scansione laser consisteva in uno specchio poligonale rotante (asse X) e uno specchio di scansione galvanometro (asse Y) che consentivano la scansione della velocità video (30 fotogrammi al secondo). Informazioni dettagliate sulla microscopia intravitale sono state descritte negli studi precedenti10,18,19,20,21,22,23.
Nel nostro precedente studio sulle isole18,abbiamo ripreso con successo e stabilmente le isole in topi vivi utilizzando un modello murino transgenico (MIP-GFP)24 in cui le isole sono state etichettate con GFP. Il metodo ha consentito la visualizzazione ad alta risoluzione dei cambiamenti negli isolotti per un periodo di 1 settimana. Ha anche facilitato l’imaging delle stesse isole per un massimo di 3 settimane, il che suggerisce la fattibilità di studi a lungo termine delle isole pancreatiche per il monitoraggio funzionale o il monitoraggio durante la patogenesi del diabete mellito18. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello di carcinoma pancreatico ortotopico in cui le cellule tumorali pancreatiche fluorescenti (PANC-1 NucLight Red)25 sono state impiantate direttamente nel pancreas del topo. Con l’applicazione della finestra di imaging intravitale pancreatico, questo modello potrebbe essere utilizzato come piattaforma per studiare la fisiopatologia cellulare e molecolare nel microambiente tumorale del cancro del pancreas e per il monitoraggio terapeutico di nuovi farmaci candidati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto consiste nell’imaging intravitale del pancreas utilizzando una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto modificata da una finestra di imaging addominale. Tra i protocolli sopra descritti, il primo passo critico è l’impianto della finestra di imaging pancreatico intravitale nel topo. Per l’applicazione della colla nella finestra, è importante applicare la colla tra il margine della finestra e il vetro di copertura, ma non sul tessuto pancreatico, in q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 14-2020-002 del Fondo di ricerca SNUBH e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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