Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática
Summary
A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.
Abstract
A imagem direta de resolução celular in vivo do pâncreas em um modelo animal pequeno vivo tem sido tecnicamente desafiadora. Um estudo recente de imagem intravital, com uma janela de imagem abdominal, possibilitou a visualização da dinâmica celular em órgãos abdominais in vivo. No entanto, devido à arquitetura macia do pâncreas do mouse que pode ser facilmente influenciada pelo movimento fisiológico (por exemplo, peristalse e respiração), foi difícil realizar imagens longitudinais estabilizadas ao longo de várias semanas no nível celular para identificar, rastrear e quantificar ilhotas ou células cancerígenas no pâncreas do rato. Aqui, descrevemos um método para implantar uma nova base de suporte, uma janela de imagem intravital pancreática integrada, que pode separar espacialmente o pâncreas do intestino para imagens intravitais longitudinal do pâncreas microestrutura. A imagem longitudinal in vivo com a janela de imagem permite a visualização estável, permitindo o rastreamento de ilhotas durante um período de 3 semanas e imagens tridimensionais de alta resolução da microestrutura, como evidenciado aqui em um modelo de câncer pancreático ortotópico. Com nosso método, novos estudos de imagem intravital podem elucidar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas a nível celular.
Introduction
O pâncreas é um órgão abdominal com uma função exócrina no trato digestivo e uma função endócrina de secretar hormônios na corrente sanguínea. Imagens celulares de alta resolução do pâncreas podem revelar a fisiopatologia de várias doenças envolvendo o pâncreas, incluindo pancreatite, câncer de pâncreas e diabetes mellitus1. Ferramentas convencionais de diagnóstico por imagem, como tomografia computadorizada, resolução magnética e ultrassonografia estão amplamente disponíveis no campo clínico1,2. No entanto, essas modalidades de imagem estão restritas à visualização apenas de alterações estruturais ou anatômicas, enquanto alterações no nível celular ou molecular não podem ser determinadas. Dado que alterações moleculares no diabetes mellitus ou câncer de pâncreas em humanos podem iniciar mais de 10 anos antes do diagnóstico3,4, a detecção de doenças pancreáticas de sua transição molecular durante o período latente tem o potencial de fornecer um diagnóstico precoce e uma intervenção oportuna. Assim, imagens que superarão as limitações da resolução e fornecerão insights valiosos sobre a função ganharão notavelmente atenção, fornecendo diagnóstico precoce de câncer de pâncreas ou identificação avançada da alteração das ilhotas durante a progressão do diabetes mellitus5.
Em particular com as ilhotas, imagens nucleares, imagens de bioluminescência e tomografia de coerência óptica têm sido sugeridas como técnicas de imagem de ilhotas não invasivas6. No entanto, a resolução desses métodos é substancialmente baixa, com valores típicos que variam de várias dezenas a centenas de micrômetros, oferecendo uma capacidade limitada para detectar alterações no nível celular nas ilhotas. Por outro lado, foram realizados estudos anteriores de alta resolução de ilhotas sob ex vivo7,8 (por exemplo, fatiamento ou digestão do pâncreas), não fisiológico9 (por exemplo, exteriorização do pâncreas) e condições heterotópicas10,11,12 (por exemplo, implantação sob a cápsula renal, dentro do fígado, e na câmara anterior do olho), o que restringe sua interpretação e implicações clínicas. Se in vivo,modelo fisiológico e ortotópico de imagem de alta resolução pode ser estabelecido, será uma plataforma crítica para a investigação de ilhotas pancreáticas.
A imagem intravital, que revela a fisiopatologia em um nível de resolução microscópica em um animal vivo, recebeu recentemente grande atenção13. Dos métodos de imagem in vivo, o desenvolvimento de uma janela de imagem abdominal14, que implanta uma janela no abdômen de um camundongo, permitiu a descoberta de novos achados (ou seja, um estágio pré-micrometastase da metástase hepática precoce15 e mecanismo de manutenção de células-tronco no epitélio intestinal16). Embora a janela de imagem abdominal forneça resultados valiosos, as aplicações desta janela para o pâncreas e a pesquisa de imagem intravital resultante baseada em doenças envolvendo pâncreas, não foram amplamente investigadas.
Ao contrário das características bem definidas do órgão sólido do pâncreas humano, o pâncreas de um camundongo é uma estrutura difusamente distribuída de tecido mole17. Portanto, é incessantemente afetada por movimentos fisiológicos, incluindo peristalse e respiração. Um estudo anterior sobre a aplicação de uma janela de imagem abdominal para o pâncreas demonstrou que a erração ocorreu devido a artefatos de movimento induzidos pelos movimentos intestinais18. A desfoca severa foi observada na imagem média resultante, o que impediu a visualização e identificação das estruturas de microescala.
Aqui, descrevemos o uso de uma nova base de apoio integrada janela de imagem intravital pancreática combinada com microscopia intravital19,20 para investigar os eventos longitudinais de nível celular em doenças envolvendo o pâncreas. Além de uma descrição detalhada da metodologia no estudo anterior18,a aplicação estendida da janela de imagem pancreática para diversas doenças envolvendo o pâncreas será abordada neste artigo. Neste protocolo, um sistema de microscopia confocal de varredura a laser de velocidade de vídeo personalizado foi utilizado como um sistema de microscopia intravital. Quatro módulos laser (comprimentos de onda em 405, 488, 561 e 640 nm) foram utilizados como fonte de excitação, e quatro canais de sinais de emissão foram detectados por tubos fotomultiplier (PMT) através de filtros de bandpass (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). A varredura a laser consistia em um espelho poligonal rotativo (eixo X) e um espelho de varredura galvanômetro (eixo Y) que permitia a digitalização da taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Informações detalhadas sobre microscopia intravital foram descritas nos estudos anteriores10,18,19,20,21,22,23.
Em nosso estudo anteriorde ilhotas 18,nós com sucesso e imagem as ilhotas em camundongos vivos usando um modelo de rato transgênico (MIP-GFP)24 em que as ilhotas foram marcadas com GFP. O método possibilitou a visualização de alta resolução das alterações nas ilhotas durante um período de 1 semana. Também facilitou a imagem das mesmas ilhotas por até 3 semanas, o que sugere a viabilidade de estudos de longo prazo das ilhotas pancreáticas para o rastreamento ou monitoramento funcional durante a patogênese do diabetes mellitus18. Além disso, desenvolvemos um modelo ortotópico de câncer de pâncreas no qual células cancerígenas pancreáticas fluorescentes (PANC-1 NucLight Red)25 foram implantadas diretamente no pâncreas do camundongo. Com a aplicação da janela de imagem intravital pancreática, este modelo poderia ser utilizado como uma plataforma para investigar a fisiopatologia celular e molecular no microambiente tumoral do câncer de pâncreas e para o monitoramento terapêutico de novos candidatos a medicamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui consiste em imagens intravitais do pâncreas usando uma nova base de suporte integrada janela de imagem intravital pancreática modificada de uma janela de imagem abdominal. Entre os protocolos descritos acima, o primeiro passo crítico é a implantação da janela de imagem pancreática intravital no camundongo. Para a aplicação da cola na janela, é importante aplicar a cola entre a margem da janela e o vidro de cobertura, mas não no tecido pancreático, pois pode interromper significativam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 14-2020-002 do Fundo de Pesquisa snubh e pela Bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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