시험관내실험용 스테토시스 모델 : 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양
Summary
이 프로토콜은 체외에서지질에 간세포의 과잉 노출에 의해 생성 된 steatosis 및 분자, 생화학, 세포 변화를 연구하는 도구가 될 것입니다.
Abstract
이전에 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)으로 알려진 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MAFLD)은 비만, 당뇨병 제2형 및 이상지질혈증과의 관계로 인해 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 간 질환입니다. 간 절제기증에 지질 방울의 축적인 간 질비증은, 염자 간염, 섬유증 및 말기 간 질환에서 관찰되는 염증을 선행하는 질병의 주요 특징이다. 간세포에 지질 축적은 xenobiotics와 내인성 분자의 적절한 신진 대사를 방해할 뿐만 아니라 질병의 진보로 이어지는 세포 과정을 유도할 수 있습니다. steatosis의 실험 연구는 생체 내에서수행 될 수 있지만, 스테토시스의 연구에 대한 체외 접근은 다른 장점을 가진 보완 도구입니다. 지질 과부하 조절 배지의 간세포 배양은 산화 및 망상 응력, 자가식, 증식, 세포사멸, 등등 지질 축적과 관련된 세포 과정의 식별을 허용하는 간 간 스테토시스 연구를 위한 우수한 재현 가능한 옵션뿐만 아니라 약물 효과성, 독성 검사 등 다른 많은 응용 분야 중에서도 볼 수 있다. 여기서, 지질 과부하 조절 배지에서 간세포 배양의 방법론을 기술하는 것을 목표로 하였다. HepG2 세포는 팔미타트 나트륨과 올레아테 나트륨으로 조절된 RMPI 1640 배지에서 배양되었다. 중요한 것은, 이 2개의 지질의 비율은 질병 도중 간에서 생기는 것과 같이 세포 증식 및 적당한 사망률을 유지하면서 지질 물방울 축적을 선호하기 위하여 중요합니다. 방법론은, 지질용액주식의 제조로부터, 혼합물, 배지, 및 간세포 배양에 첨가된 것이 도시된다. 이 접근법으로, 오일 레드 O 스테인링에 의해 쉽게 관찰 할 수있는 간세포에서 지질 방울뿐만 아니라 증식 / 사망률의 곡선을 식별 할 수 있습니다.
Introduction
신진 대사 기능 장애와 관련 된 지방 간은 전 세계적으로 매우 널리 퍼집니다1,2; 인구의 최대 25%가3에영향을 받는 것으로 추정됩니다. 이전에 비알코올성 지방간질환(NAFLD)으로 알려진 이 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병형 2형, 이상지질혈증과 관련된 병발생을 정확하게 반영하기 위해 대사 기능 장애관련 지방간질환(MAFLD)에 대한 명칭을 업데이트하고 있으며, 질병3,4의가능한 관리와 함께 가능하다.
이름에 관계없이, 질병은 간에서 지질의 비정상적으로 높은 축적을 특징으로 하는 조직 병리학적 변화의 넓은 스펙트럼을 포함 (>5% 간세포에서 지방의 지방의5)그리고 일반적으로 간단한 steatosis에서 발견 지질 축적을 통해 진행 될 수 있습니다., 차례로 섬유증의 개발로 이어질 수 있습니다., cirrhis, cirrhisis의 개발로 이어질 수 있습니다. 간세포 암및 간부전5,6,7,8. 그것의 증가 보급 때문에, MAFLD는 간 이식의 첫번째 표시 및 간세포암9의주요한 원인이 될 것으로 예상됩니다.
그것은 지방 간 질환의 양성 또는 온화한 형태로 간주 되었지만, 간 steatosis는 사실 MAFLD에서 신진 대사 키10. 다른 신진 대사 경로는 간에서 지질 축적에 의해 영향을 받습니다., 포함 하 여 하지만 지질 합성에 제한, 수출, 그리고 신진 대사10. 인슐린 저항성, 산화 스트레스, 망상 스트레스 및 세포 기능 장애는 간 리포독성(11,12)과강하게 연관된다. 한편, 지방 간세포는 반응성 산소 종의 표적으로, 지질 과산화물, 단백질 탄산염 및핵산(13)의부관으로 대사산물을 렌더링한다. 세포 수준에서, 지방 간세포는 미토콘드리아손상(14,세포 노화15,세포 노화16,파이롭토시스12,및자가식(17)을겪을 수 있다.
간세포는 신진 대사에 대 한 높은 책임, 해독, 그리고 분자의 넓은 범위의 합성. 이러한 기능의 대부분은 steatosis에서 관찰 된 지질 축적에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서 steatosis를 정확하게 평가할 수 있는 재현 가능한 도구를 갖는 것이 매우 중요합니다. 이러한 의미에서 체외 모델은 쉽게 적용 가능하고 재현성이 높습니다. 체외에서 Steatosis는 다른 목표와 함께 사용 되었습니다16,18,19. HepG2 세포는 간세포 세포주로서 널리 사용된다. 문화가 쉽고 잘 특징지어지는 등의 장점이 있습니다. 아마도 HepG2 세포의 유일한 단점은 발암 세포주라는 사실이므로 결과를 분석 할 때 고려해야합니다. 여기서, 세포 배양에 널리 사용되는 지방산의 혼합물의 적용이 도시된다: 팔미산(PA) 및 올레산(OA)이 도시된다. PA와 OA 모두 문화20에서다른 결과를 제공합니다. PA(C 16:0)는 다이어트16에서얻은 가장 흔한 포화 지방산이다. PA는 NAFLD21의개발에 중요한 단계인 드노보 리포게네시스의바이오마커로 간주됩니다. PA는 매우 독성이 높은 것으로 나타났다22; 따라서 시험관내에서스테토시스를 유도하는 것이 좋습니다. OA (C 18:1)는 단일 불포화 지방산이다. PA와 는 달리, OA는 항 염증 및 산화 성분을 소유하는 것이 제안되었으며 PA12에중화할 수 있습니다. PA와 OA 는 모두 건강 또는질병(16)의상태에 관계없이 트리글리세라이드에 존재하는 주요 지방산이다. 표 1은 PA, OA 및 그 혼합물을 가진 간세포 배양의 예를 제공하며,12,23,24,25,26,27을보고한 결과도 제공한다. 다른 지방산은 또한 스테레산(C 18:0)28,29,30,리놀레산(C 18:1)28,30,31 및 그 컨쥬게이트(CLA)28,32,팔미톨레산(C 16:1)29를포함하는 간세포 배양에도 사용되어 왔다. 그러나, 그들의 사용은 문헌에서 가장 자주 보고됩니다, 아마도 그들의 간 풍부가 PA와 OA16보다는 더 낮기 때문에.
함께, 두 지방산은 시험관 내의 스테토시스와 유사하여, 증식 세포를 제공하며, 세포 사망률이 증가하고 대조군 조건에 비해 생존가능성이 낮습니다. 이러한 지방산의 각 염분도 사용할 수 있으며 사용할 수 있다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 간세포 배양에서 지질 과부하를 평가할 때 주요 문제 중 하나는 독성 모델과 스테토시스를 가장 잘 나타내는 모델 간의 분화에서 주어진다. 첫 번째 경우많은 모델을 설명할 수 있습니다. 사실, PA의 사용만으로도 그 중에서도 고려될 수 있으며, 사망률이 가장 높은 결과는12,16,23,24,25,26, 26,27로가장 뚜렷한 결과이다. OA의 경우에도 고용량의 사용은 독성 모델로 간주 될 수있다. 여기에 표시된 프로토콜은 다른 모델에서 관찰된 것과 비교하여 낮은 사망률을 나타내고 NAFLD에서 발생하는 점진적 지질 축적으로 며칠 동안 따를 수 있기 때문에 steatosis 발달에 따라 더 높습니다. 실험 조건을 통해 경미하고 가혹한 steatosis를 평가하는 가능성은 또 다른 이점으로 간주됩니다.
| 지방산 | 여건 | 결과 | 참조 | ||
| PA | 농도: 200 μM | 지질 축적 | Yan et al, 201925. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 간세포 손상 | ||||
| 트라미나제 고도 | |||||
| PA | 농도: 50, 100 및 200 μM | 지질 축적 | Xing 외, 201924. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| PA | 농도: 250 μM, 500 μM, 750 μM 및 1,000 μM | 지질 축적 | 왕 외, 202026. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 세포 생존가능성의 점진적 감소 | ||||
| OA/PA의 혼합 | 농도: 1 mM | 지질 축적 | 샤오 외, 202027. | ||
| 시간 노출: 24 시간 | 리포 독성을 보고하지 않음 | ||||
| 요금: 2OA:1PA | |||||
| OA/PA의 혼합 | PA 200 μM 및 400 μM의 첫 번째 자극 및 OA 200 μM의 두 번째 자극 | 지질 축적. | Zeng 외, 202012. | ||
| 농도:400 μM PA: 200 μM OA | PA에 의해 유도된 지방 독성의 증거는 OA의 자극에 의해 감소되었다. | ||||
| 요금: 2PA:1OA | |||||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| OA/PA의 혼합 | 농도: 400 μM PA: 200 μM OA | 지질 축적 | 첸 외, 201823. | ||
| 요금: 2PA:1OA | |||||
| 시간 노출: 24 시간 | |||||
| OA/PA의 혼합 | 농도 :50 및 500 μM | 두 가지 유형의 스테토시스 의 생성 : 온화한 스테토시스와 심한 스테토시스. |
캄포스와 구즈만 2021 | ||
| 요금: 2PA:1OA | 지질 과부하의 만성 박람회 시뮬레이션 | ||||
| 시간 노출: 24시간, 2일, 3일, 4일. | |||||
표 1. 스테토원성 조건에서 간세포 배양. 표는 사용된 지방산의 모형, 유지된 조건 및 간세포 배양에 있는 관찰된 결과를 제시합니다. PA: 팔미산. OA: 올레산.
마지막으로,이 모델은 steatosis와 지방 간뿐만 아니라 steatosis의 맥락에서 간 대사, 합성 및 해독 경로에 적용 할 수 있습니다. 또한, 체외 유도 된 steatosis 질병의 잠재적인 마커뿐만 아니라 치료 대상의 식별에 대 한 증거를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 시험관 내에서steatosis를 연구하는 전략을 제공하기 위한 것입니다. 세포 배양은 세포, 분자, 생화학 및 다른 조건에 노출된 세포의 독성학적 측면을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 접근법으로, steatosis는 MAFLD인 복잡한 질병의 단계로뿐만 아니라 지질에 대한 간세포 과다 노출 및 그러한 노출로 인한 가능한 결과로 도포될 수 있습니다. 따라서, 그것의 응용 프로그램은 MAFLD의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y Tecnología (코나시트, CB-221137)에 의해 투자되었다. 아드리아나 캄포스는 플라스타 드 닥터라도 엔 시엔시아스 비오메디카, 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코의 박사 과정 학생이며, 코나시트(CVU: 1002502)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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