En modell av eksperimentell steatose in vitro: Hepatocyte cellekultur i Lipid overbelastningskondisjonerte medium

Summary

Denne protokollen er ment å være et verktøy for å studere steatose og molekylære, biokjemiske, cellulære endringer produsert ved overeksponering av hepatocytter til lipider in vitro.

Abstract

Metabolsk dysfunksjon-assosiert fettleversykdom (MAFLD), tidligere kjent som alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), er den mest utbredte leversykdommen over hele verden på grunn av forholdet til fedme, diabetes type 2 og dyslipidemi. Leversteatose, akkumulering av lipiddråper i leverparenchyma, er et sentralt trekk ved sykdommen før betennelsen observert i steatohepatitt, fibrose og end-stage leversykdom. Lipidakkumulering i hepatocytter kan forstyrre riktig metabolisme av xenobiotika og endogene molekyler, samt å indusere cellulære prosesser som fører til sykdomsforløpet. Selv om den eksperimentelle studien av steatose kan utføres in vivo, in vitro tilnærminger til studiet av steatose er komplementære verktøy med forskjellige fordeler. Hepatocyttkultur i lipid overbelastningskondisjonerte medium er et utmerket reproduserbart alternativ for studiet av leversteatose som tillater identifisering av cellulære prosesser relatert til lipidakkumulering, for eksempel oksidative og retikulære stress, autofagi, spredning, celledød, etcetera, samt andre tester, inkludert legemiddeleffektivitet og toksikologiske tester, blant mange andre mulige applikasjoner. Her var det rettet mot å beskrive metodikken til hepatocyttcellekultur i lipid overbelastningskondisjonerte medium. HepG2 celler ble dyrket i RMPI 1640 medium betinget med natrium palmitate og natrium oleate. Viktigst, forholdet mellom disse to lipidene er avgjørende for å favorisere lipiddråpeakkumulering, samtidig som celleproliferasjon og moderat dødelighet opprettholdes, som forekommer i leveren under sykdommen. Metodikken, fra utarbeidelsen av lipidoppløsningsbestandene, vises blanding, tillegg til mediet og hepatocyttkulturen. Med denne tilnærmingen er det mulig å identifisere lipiddråper i hepatocyttene som er lett observerbare av oljerød O-farging, samt kurver av spredning / dødelighet.

Introduction

Fettlever forbundet med metabolsk dysfunksjon er svært utbredt over hele verden^1,2; Det anslås at opptil 25% av befolkningen påvirkes³. Denne sykdommen tidligere kjent som alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), har oppdatert sin nomenklatur til metabolsk dysfunksjon assosiert fettleversykdom (MAFLD) for å nøyaktig reflektere patogenesen relatert til fedme, insulinresistens, diabetes type 2 og dyslipidemi, samt mulige styringer av sykdommen^3,4.

Uansett navn inneholder sykdommen et bredt spekter av histopatologiske endringer preget av unormalt høy akkumulering av lipider i leveren (>5% fett i hepatocyttene⁵) og kan utvikle seg gjennom lipidakkumulering som vanligvis finnes i enkel steatohepatitt, noe som igjen kan føre til utvikling av fibrose, skrumplever, hepatocellulært karsinom og leversvikt^5,6,7,8. På grunn av sin økende utbredelse forventes MAFLD å bli den første indikasjonen på levertransplantasjon og den ledende årsaken til hepatocellulært karsinom⁹.

Selv om det har blitt ansett som en godartet eller mild form for fettleversykdom, er leversteatose faktisk den metabolske nøkkelen i MAFLD¹⁰. Ulike metabolske veier påvirkes av lipidakkumulering i leveren, inkludert, men ikke begrenset til lipidsyntese, eksport og metabolisme¹⁰. Insulinresistens, oksidativt stress, retikulært stress og cellulær dysfunksjon er sterkt forbundet med leverletoksisitet^11,12. På den annen side er fete hepatocytter målet for reaktive oksygenarter, noe som gjør metabolitter som lipidperoksider, proteinkarbonyler og addukter av nukleinsyrer¹³. På cellenivå kan fett hepatocytter gjennomgå mitokondrieskade¹⁴, cellulær senescence¹⁵, apoptose¹⁶, pyroptose¹²og autofagi¹⁷, blant andre hendelser.

Hepatocytter er svært ansvarlige for metabolisme, avgiftning og syntese av et bredt spekter av molekyler. Mange av disse funksjonene kan bli kompromittert av lipidakkumulering observert ved steatose. Derfor er det av stor betydning å ha reproduserbare verktøy som tillater en nøyaktig evaluering av steatose. I denne forstand er in vitro-modeller lett anvendelige og svært reproduserbare. Steatose in vitro har blitt brukt med forskjellige mål^16,18,19. HepG2-cellene er mye brukt som hepatocyttcellelinje. Det har fordeler som å være lett å kultur og godt karakterisert. Kanskje er den eneste ulempen ved HepG2-celler det faktum at det er en kreftfremkallende cellelinje, så dette må vurderes når du analyserer resultatene. Her vises anvendelsen av en blanding av fettsyrer som er mye brukt i cellekulturen: palmittsyre (PA) og oljesyre (OA). Både PA og OA tilbyr forskjellige resultater i kultur²⁰. PA (C 16:0) er den vanligste mettede fettsyren oppnådd fra dietten¹⁶. PA regnes som en biomarkør for de-novo lipogenese, et avgjørende skritt i utviklingen av NAFLD²¹. PA er vist å være svært giftig²²; Derfor kan det ikke anbefales å indusere steatose in vitro. OA (C 18:1) er en enumettet fettsyre. I motsetning til PA har OA blitt foreslått å ha antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper, og kunne motvirke PA¹². Både PA og OA er de viktigste fettsyrene som er tilstede i triglyseridene, uavhengig av tilstanden til helse eller sykdom¹⁶. Tabell 1 inneholder eksempler på hepatocyttkulturen med PA, OA og deres blanding, i tillegg til resultatene som er rapportert^{12,23,24,25,26,27}. Andre fettsyrer har også blitt brukt i hepatocyttkultur, inkludert stearinsyre (C 18:0)^28,29,30, linolsyre (C 18:1)^28,30,31 og dens konjugater (CLA)^28,32, palmitoleinsyre (C 16:1)²⁹. Imidlertid er deres bruk minst ofte rapportert i litteraturen, kanskje fordi deres lever overflod er lavere enn PA og OA¹⁶.

I forbindelse ligner begge fettsyrene steatose in vitro, gir proliferating celler, med økt celledød og lavere levedyktighet sammenlignet med kontrollforhold. Det er verdt å nevne at de respektive saltene til disse fettsyrene er tilgjengelige og også kan brukes. Et av hovedproblemene ved vurdering av lipidoverbelastning i hepatocytcellekultur er gitt i differensiering mellom toksikologiske modeller og en modell som best representerer steatose. Mange modeller kan redegjøres i det første tilfellet. Faktisk kan bruken av PA alene vurderes blant dem, og den høye dødeligheten er det mest åpenbare utfallet^{12,16,23,24,25,26,27}. Bruk av høye doser selv ved OA kan også betraktes som en toksikologisk modell. Protokollen som vises her er i høyere samsvar med steatoseutvikling siden den viser lav dødelighet sammenlignet med den som er observert i andre modeller og gjør at den kan følges i løpet av flere dager med progressiv lipidakkumulering som det forekommer i NAFLD. Muligheten til å vurdere mild og alvorlig steatose gjennom eksperimentelle forhold regnes som en annen fordel.

Fettsyrer	Betingelser		Resultater		Referanse
PA	Konsentrasjon: 200 μM		Lipid akkumulering		Yan et al, 201925.
	Tidseksponering: 24 timer		Hepatocyte skade
			Transaminaser høyde
PA	Konsentrasjon: 50, 100 og 200 μM		Lipid akkumulering		Xing et al, 201924.
	Tidseksponering: 24 timer
PA	Konsentrasjon: 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM		Lipid akkumulering		Wang et al, 202026.
	Tidseksponering: 24 timer		Progressiv reduksjon av celle levedyktighet
Blanding av OA/PA	Konsentrasjon: 1 mM		Lipid akkumulering		Xiao et al, 202027.
	Tidseksponering: 24 timer		Rapporterer ikke liptoksisitet
	Hastighet: 2OA:1PA
Blanding av OA/PA	Første stimulering med 200 μM og 400 μM PA og deretter andre stimulering med 200 μM OA		Lipid akkumulering.		Zeng et al, 202012.
	Konsentrasjon: 400 μM PA: 200 μM OA		Tegn på lipotoksisitet indusert av PA ble redusert ved stimulering av OA.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidseksponering: 24 timer
Blanding av OA/PA	Konsentrasjon: 400 μM PA: 200 μM OA		Lipid akkumulering		Chen et al, 201823.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidseksponering: 24 timer
Blanding av OA/PA	Konsentrasjon : 50 og 500 μM		Generering av to typer steatose: mild steatose og alvorlig steatose.		Campos og Guzmán 2021
	Pris: 2PA:1OA		Simulerer kronisk utstilling av lipidoverbelastning
	Tidseksponering: 24 timer, 2 dager, 3 dager og 4 dager.

Tabell 1. Hepatocyttkultur i steatogene forhold. Tabellen presenterer typen fettsyre som brukes, forholdene opprettholdes og de observerte resultatene i hepatocyttkulturen. Palmitisk syre. OA: Oljesyre.

Til slutt gjelder denne modellen ikke bare for studiet av steatose og fettlever, men også for levermetabolismen, syntetiske og avgiftningsveiene i sammenheng med steatose. Også in vitro indusert steatose kan gi bevis for identifisering av potensielle markører av sykdommen samt terapeutiske mål.

Protocol

1. Standard og betinget medium forberedelse For å forberede standard RPMI 1640, supplere RPMI 1640 kulturmedium med 10% (v / v) foster bovint serum (FBS, tidligere varmeinaktivert) og 1% (v / v) av Penicillin-Streptomycin løsning. Oppbevar mediet ved 4 °C.Steriliser ved hjelp av 0,22 μm filtre. For å forberede palmitate lagerløsning, lag en 50 mM løsning av palmitate i standard RPMI 1640 tidligere supplert med 1% bovint serumalbumin (lipidfri). Et volum på 5-10 ml av dette lageret vil være ti…

Representative Results

Hepatocytter dyrket i den steatogene medium displayveksten over hele overflaten av brønnen; Imidlertid viser fete hepatocytter lavere vekstrate sammenlignet med celler dyrket i kontrollmedium. Det foreslåtte forholdet og konsentrasjonen av OA og PA garanterer celleoverlevelse under kultur. Såing 1 x 105 celler per brønn i 24-brønnsplater gir optimal samløp som vist i figur 1. Levedyktigheten i dyrkede celler var lavere i desteatogene gruppene Mild…

Discussion

Denne protokollen er ment å gi en strategi for å studere steatose in vitro. Cellekultur er et kraftig verktøy for å studere cellulære, molekylære, biokjemiske og toksikologiske aspekter av cellene utsatt for forskjellige forhold. Med denne tilnærmingen kan steatose visualiseres ikke bare som et stadium av den komplekse sykdommen som er MAFLD, men også som hepatocyt overeksponering til lipider og mulige utfall som følge av slik eksponering. Derfor er søknaden ikke begrenset til fysiopatologien til MAFLD…

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.