Bu protokol, steatozu ve hepatositlerin lipitlere aşırı maruz kalmasıyla ortaya çıkardığı moleküler, biyokimyasal, hücresel değişiklikleri incelemek için bir araç olması amaçlanmıştır.
Metabolik disfonksiyon ilişkili yağlı karaciğer hastalığı (MAFLD), daha önce alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) olarak bilinir, obezite, diyabet tip 2 ve dislipidemi ile ilişkisi nedeniyle dünya çapında en yaygın karaciğer hastalığıdır. Karaciğer parankiminde lipit damlacıklarının birikmesi olan hepatik steatoz, steatohepatit, fibrozis ve son evre karaciğer hastalığında gözlenen iltihaplanmadan önce hastalığın önemli bir özelliğidir. Hepatositlerde lipit birikimi, ksenobiyotiklerin ve endojen moleküllerin uygun metabolizmasını ve hastalığın ilerlemesine yol açan hücresel süreçleri teşvik etmeyi engelleyebilir. Steatozun deneysel çalışması in vivoolarak yapılabilmesine rağmen, steatoz çalışmasına in vitro yaklaşımlar farklı avantajlara sahip tamamlayıcı araçlardır. Lipid aşırı yük şartlandırılmış ortamdaki hepatosit kültürü, oksidatif ve retiküler gerilmeler, otofaji, çoğalma, hücre ölümü vb. Burada lipid aşırı yük şartlandırılmış ortamda hepatosit hücre kültürünün metodolojisinin anlatılması amaçlanmıştır. HepG2 hücreleri RMPI 1640 ortamında sodyum palmitat ve sodyum oleat ile şartlandırılmış olarak kültürlendi. Daha da önemlisi, bu iki lipitin oranı lipid damlacık birikimini tercih etmek için çok önemlidir, ancak hastalık sırasında karaciğerde olduğu gibi hücre çoğalmasını ve orta derecede ölüm oranını korur. Lipid çözeltisi stoklarının hazırlanmasından, karışıma, ortama ek olarak ve hepatosit kültüründen metodoloji gösterilmiştir. Bu yaklaşımla, yağ-kırmızı O lekeleme ile kolayca gözlemlenebilen hepatositlerdeki lipit damlacıklarının yanı sıra çoğalma/mortalite oranları eğrilerini tanımlamak mümkündür.
Metabolik disfonksiyon ile ilişkili yağlı karaciğer dünya çapında oldukça yaygındır1,2; nüfusun % 25’ine kadar etkilendiği tahmin edilmektedir3. Daha önce alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) olarak bilinen bu hastalık, obezite, insülin direnci, diyabet tip 2 ve dislipidemi ile ilgili patogenezin yanı sıra hastalığın olası yönetimlerini doğru bir şekilde yansıtacak şekilde nomenklatürünü metabolik disfonksiyon ilişkili yağlı karaciğer hastalığına (MAFLD) güncelledi3,4.
Adından bağımsız olarak, hastalık karaciğerde anormal derecede yüksek lipit birikimi ile karakterize geniş bir histopatolojik değişiklik spektrumu içerir (hepatositlerdeki yağın%>5’i 5)ve tipik olarak basit steatotozda bulunan lipit birikiminden steatohepatite ilerleyebilir, bu da fibrozis, siroz gelişimine yol açabilir, hepatosellüler karsinom ve karaciğer yetmezliği5,6,7,8. Artan prevalansı nedeniyle MAFLD’nin karaciğer naklinin ilk göstergesi ve hepatosellüler karsinomun önde gelen nedeni olması beklanmaktadır9.
Yağlı karaciğer hastalığının iyi huylu veya hafif bir formu olarak kabul edilmesine rağmen, hepatik steatoz aslında MAFLD10’dametabolik anahtardır. Farklı metabolik yollar, lipid sentezi, ihracat ve metabolizma dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere karaciğerdeki lipit birikimini etkiler10. İnsülin direnci, oksidatif stres, retiküler stres ve hücresel işlev bozukluğu hepatik lipotoksite ile güçlü bir şekilde ilişkilidir11,12. Öte yandan, yağlı hepatositler reaktif oksijen türlerinin hedefidir, metabolitleri lipid peroksitler, protein karboniller ve nükleik asitlerin adductları olarak oluşturur13. Hücresel düzeyde, yağlı hepatositler diğer olayların yanı sıra mitokondriyal hasar14, hücresel senescence15, apoptoz16, piroptoz12ve otofaji17’yemaruz kalabilir.
Hepatositler metabolizma, detoksifikasyon ve çok çeşitli moleküllerin sentezinden oldukça sorumludur. Bu fonksiyonların çoğu steatozda gözlenen lipit birikimi ile tehlikeye atılabilir. Bu nedenle, steatozun doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan tekrarlanabilir araçlara sahip olmak büyük önem taşımaktadır. Bu anlamda, in vitro modeller kolayca uygulanabilir ve oldukça tekrarlanabilir. Steatoz in vitro farklı hedeflerle kullanılmıştır16,18,19. HepG2 hücreleri hepatosit hücre hattı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kültüre kolay ve iyi karakterize olmak gibi avantajları vardır. Belki de, HepG2 hücrelerinin tek dezavantajı kanserojen bir hücre hattı olmasıdır, bu nedenle sonuçları analiz ederken bu dikkate alınmalıdır. Burada, hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan yağ asitlerinin bir karışımının uygulanması: palmitik asit (PA) ve oleik asit (OA) gösterilmiştir. Hem PA hem de OA kültürde farklı sonuçlar sunar20. PA (C 16:0) diyetten elde edilen en yaygın doymuş yağ asididir16. PA, DE-novo lipogenezibiyobelirteç olarak kabul edilir NAFLD21’ingeliştirilmesinde önemli bir adım. PA’nın oldukça zehirli olduğu gösterilmiştir22; bu nedenle, steatoz in vitroindükle tavsiye edilmeyebilir. OA (C 18:1) tekli doymamış bir yağ asididir. PA’nın aksine, OA’nın anti-enflamatuar ve anti-oksidan özelliklere sahip olduğu ve PA12’yekarşı koyabildiği öne sürülüyor. Hem PA hem de OA, sağlık veya hastalık durumundan bağımsız olarak trigliseritlerde bulunan ana yağ asitleridir16. Tablo 1, PA, OA ve karışımları ile hepatat kültürüne ve 12 , 23 , 24,25,26,27bildirilen sonuçlara örnekler sağlar. Stearik asit (C 18:0) 28 , 29 , 30,linoleik asit (C18:1)28,30,31 ve konjugeleri (CLA)28,32,palmitoleik asit (C16:1)29dahil olmak üzere diğer yağ asitleri de hepatosit kültüründe kullanılmıştır. Bununla birlikte, kullanımları literatürde en az sıklıkla bildiriliyor, belki de hepatik bollukları PA ve OA16’dandaha düşük olduğu için .
Birlikte, her iki yağ asidi de steatoz in vitro, çoğalmış hücreler sağlar, hücre ölümü artar ve kontrol koşullarına kıyasla daha düşük canlılık sağlar. Bu yağ asitlerinin ilgili tuzlarının mevcut olduğunu ve kullanılabileceğini belirtmek gerekir. Hepatosit hücre kültüründe lipid aşırı yüklemesini değerlendirirken temel sorunlardan biri toksikolojik modeller ile steatozu en iyi temsil eden bir model arasındaki farklılaşmada verilmiştir. Birçok model ilk durumda hesaba katılabilir. Aslında, pa kullanımı tek başına bunlar arasında düşünülebilir ve yüksek mortalite en belirgin sonuçtur12,16,23,24,25,26,27. OA durumunda bile yüksek dozların kullanılması toksikolojik bir model olarak da düşünülebilir. Burada gösterilen protokol steatoz gelişimine daha yüksektir, çünkü diğer modellerde gözlenenlere kıyasla düşük mortalite gösterir ve NAFLD’de meydana geldiği gibi progresif lipit birikimi ile birkaç gün boyunca takip edilmesine izin verir. Hafif ve şiddetli steatozu deneysel koşullarla değerlendirme olasılığı da başka bir avantaj olarak kabul edilir.
Yağ asitleri | Koşul -ları | Sonuç -ları | Referans | ||
PA | Konsantrasyon: 200 μM | Lipid birikimi | Yan ve ark, 201925. | ||
Zamana maruz kalma: 24 saat | Hepatosit hasarı | ||||
Transaminaz yüksekliği | |||||
PA | Konsantrasyon: 50, 100 ve 200 μM | Lipid birikimi | Xing ve ark, 201924. | ||
Zamana maruz kalma: 24 saat | |||||
PA | Konsantrasyon: 250 μM , 500 μM , 750 μM ve 1.000 μM | Lipid birikimi | Wang ve arkadaşları, 202026. | ||
Zamana maruz kalma: 24 saat | Hücre canlılığının aşamalı olarak azaltılması | ||||
OA/PA Karışımı | Konsantrasyon: 1 mM | Lipid birikimi | Xiao ve arkadaşları, 202027. | ||
Zamana maruz kalma: 24 saat | Lipotoksikliği bildirmez | ||||
Oran: 2OA:1PA | |||||
OA/PA Karışımı | önce 200 μM ve 400 μM PA ile stimülasyon ve ardından 200 μM OA ile ikinci stimülasyon | Lipid birikimi. | Zeng ve ark, 202012. | ||
Konsantrasyon:400 μM PA: 200 μM OA | PA’nın neden olduğu lipotoksiklik kanıtı OA’nın uyarılmasıyla azaldı. | ||||
Oran: 2PA:1OA | |||||
Zamana maruz kalma: 24 saat | |||||
OA/PA Karışımı | Konsantrasyon: 400 μM PA: 200 μM OA | Lipid birikimi | Chen ve arkadaşları, 201823. | ||
Oran: 2PA:1OA | |||||
Zamana maruz kalma: 24 saat | |||||
OA/PA Karışımı | Konsantrasyon :50 ve 500 μM | İki tip steatoz üretimi: hafif steatoz ve şiddetli steatoz. |
Campos ve Guzmán 2021 | ||
Oran: 2PA:1OA | Lipid aşırı yüklemesinin kronik sergisini simüle eder | ||||
Zamana maruz kalma: 24 saat, 2 gün, 3 gün ve 4 gün. |
Tablo 1. Steatojenik koşullarda hepatosit kültürü. Tablo, kullanılan yağ asidinin türünü, tutulan koşulları ve hepatosit kültüründe gözlenen sonuçları sunar. PA: Palmitik asit. OA: Oleik asit.
Son olarak, bu model sadece steatoz ve yağlı karaciğer çalışması için değil, aynı zamanda steatoz bağlamında hepatik metabolik, sentetik ve detoksifikasyon yolları için de geçerlidir. Ayrıca, in vitro indüklenen steatoz, hastalığın potansiyel belirteçlerinin ve terapötik hedeflerin tanımlanması için kanıt sağlayabilir.
Bu protokol steatoz in vitro çalışmak için bir strateji sağlamak için tasarlanmıştır. Hücre kültürü, farklı koşullara maruz kalan hücrelerin hücresel, moleküler, biyokimyasal ve toksikolojik yönlerini incelemek için güçlü bir araçtır. Bu yaklaşımla steatoz sadece MAFLD olan karmaşık hastalığın bir aşaması olarak değil, aynı zamanda lipitlere aşırı maruz kalma ve bu maruziyetten kaynaklanan olası sonuçlar olarak da görselleştirilebilir. Bu nedenle, uygulaması MAFLD’nin …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137) tarafından finanse edildi. Adriana Campos, Program de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México’da doktora öğrencisidir ve Conacyt (CVU: 1002502) tarafından desteklenmiştir.
Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |