Un modèle de stéatose expérimentale in vitro: culture de cellules hépatocytaires dans un milieu conditionné par surcharge lipidique

Summary

Ce protocole se veut un outil d’étude de la stéatose et des changements moléculaires, biochimiques, cellulaires produits par la surexposition des hépatocytes aux lipides in vitro.

Abstract

La stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD), précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), est la maladie du foie la plus répandue dans le monde en raison de sa relation avec l’obésité, le diabète de type 2 et la dyslipidémie. La stéatose hépatique, l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans le parenchyme hépatique, est une caractéristique clé de la maladie précédant l’inflammation observée dans la stéatohépatite, la fibrose et la maladie hépatique terminale. L’accumulation de lipides dans les hépatocytes pourrait interférer avec le métabolisme approprié des xénobiotiques et des molécules endogènes, ainsi que pour induire des processus cellulaires conduisant à l’avancée de la maladie. Bien que l’étude expérimentale de la stéatose puisse être réalisée in vivo,les approches in vitro pour l’étude de la stéatose sont des outils complémentaires avec différents avantages. La culture d’hépatocytes dans un milieu conditionné par surcharge lipidique est une excellente option reproductible pour l’étude de la stéatose hépatique permettant l’identification des processus cellulaires liés à l’accumulation de lipides, tels que les stress oxydatifs et réticulaires, l’autophagie, la prolifération, la mort cellulaire, etc., ainsi que d’autres tests, y compris l’efficacité des médicaments et les tests toxicologiques, parmi de nombreuses autres applications possibles. Ici, il s’agissait de décrire la méthodologie de la culture de cellules hépatocytaires dans un milieu conditionné par une surcharge lipidique. Les cellules HepG2 ont été cultivées dans un milieu RMPI 1640 conditionné avec du palmitate de sodium et de l’oléate de sodium. Il est important de noter que le rapport de ces deux lipides est crucial pour favoriser l’accumulation de gouttelettes lipidiques, tout en maintenant la prolifération cellulaire et un taux de mortalité modéré, comme cela se produit dans le foie pendant la maladie. La méthodologie, à partir de la préparation des stocks de solution lipidique, du mélange, de l’addition au milieu et de la culture d’hépatocytes est montrée. Avec cette approche, il est possible d’identifier les gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes qui sont facilement observables par coloration O rouge huile, ainsi que les courbes des taux de prolifération / mortalité.

Introduction

La stéatose hépatique associée à un dysfonctionnement métabolique est très répandue dans le monde^{entier 1,2}; on estime que jusqu’à 25% de la population est touchée³. Cette maladie précédemment connue sous le nom de stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), a mis à jour sa nomenclature pour la stéatose hépatique associée au dysfonctionnement métabolique (MAFLD) afin de refléter avec précision la pathogenèse liée à l’obésité, à la résistance à l’insuline, au diabète de type 2 et à la dyslipidémie, ainsi que les prises en charge possibles de la maladie^3,4.

Quel que soit son nom, la maladie comprend un large spectre de changements histopathologiques caractérisés par une accumulation anormalement élevée de lipides dans le foie (>5% de graisse dans les hépatocytes⁵) et pourrait progresser à travers l’accumulation de lipides généralement trouvée dans la stéatose simple à la stéatohépatite, ce qui à son tour pourrait conduire au développement de fibrose, cirrhose, carcinome hépatocellulaire et insuffisance hépatique^5,6,7,8. En raison de sa prévalence croissante, maFLD devrait devenir la première indication de transplantation hépatique et la principale cause de carcinome hépatocellulaire⁹.

Bien qu’elle ait été considérée comme une forme bénigne ou bénigne de stéatose hépatique, la stéatose hépatique est en fait la clé métabolique de MAFLD¹⁰. Différentes voies métaboliques sont affectées par l’accumulation de lipides dans le foie, y compris, mais sans s’y limiter, la synthèse, l’exportation et le métabolisme des lipides¹⁰. La résistance à l’insuline, le stress oxydatif, le stress réticulaire et le dysfonctionnement cellulaire sont fortement associés à la lipotoxicité hépatique^11,12. D’autre part, les hépatocytes gras sont la cible d’espèces réactives de l’oxygène, rendant les métabolites sous forme de peroxydes lipidiques, de carbonyles protéiques et d’adductions d’acides nucléiques¹³. Au niveau cellulaire, les hépatocytes gras peuvent subir des dommages mitochondriaux¹⁴, la sénescence cellulaire¹⁵, l’apoptose¹⁶, la pyroptose¹²et l’autophagie¹⁷, entre autres événements.

Les hépatocytes sont hautement responsables du métabolisme, de la désintoxication et de la synthèse d’un large éventail de molécules. Beaucoup de ces fonctions pourraient être compromises par l’accumulation de lipides observée dans la stéatose. Par conséquent, il est d’une grande importance de disposer d’outils reproductibles qui permettent une évaluation précise de la stéatose. En ce sens, les modèles in vitro sont facilement applicables et hautement reproductibles. La stéatose in vitro a été utilisée avec différents objectifs^16,18,19. Les cellules HepG2 sont largement utilisées comme lignée cellulaire hépatocytaire. Il a des avantages tels que facile à culture et bien caractérisé. Peut-être, le seul inconvénient des cellules HepG2 est le fait qu’il s’agit d’une lignée cellulaire cancérigène, donc cela doit être pris en compte lors de l’analyse des résultats. Ici, l’application d’un mélange d’acides gras largement utilisés en culture cellulaire: l’acide palmitique (PA) et l’acide oléique (OA) est montrée. L’AP et l’OA offrent des résultats différents dans la culture²⁰. PA (C 16:0) est l’acide gras saturé le plus commun obtenu à partir de l’alimentation¹⁶. La PA est considérée comme un biomarqueur de la lipogenèse de novo,une étape cruciale dans le développement de la NAFLD^21. Il est démontré que l’AP est très toxique²²; par conséquent, il pourrait ne pas être recommandé d’induire la stéatose in vitro. L’arthrose (C 18:1) est un acide gras monoinsaturé. Contrairement à l’AP, il a été suggéré que l’arthrose possède des propriétés anti-inflammatoires et anti-oxydantes, étant capable de contrer la PA^12. L’AP et l’ARTH sont les principaux acides gras présents dans les triglycérides, quel que soit l’état de santé ou la maladie¹⁶. Le tableau 1 fournit des exemples de la culture d’hépatocytes avec PA, OA et leur mélange, ainsi que les résultats rapportés^{12,23,24,25,26,27}. D’autres acides gras ont également été utilisés en cultured’hépatocytes, notamment l’acide stéarique (C 18:0)^{28 , 29,30}, l’acide linoléique (C 18:^{1) 28,30,31} et ses conjugués (CLA)^28,32, l’acide palmitoléique (C 16: 1)²⁹. Cependant, leur utilisation est moins fréquemment rapportée dans la littérature, peut-être parce que leur abondance hépatique est inférieure à celle de l’AP et de l’OA^16.

En conjonction, les deux acides gras ressemblent à la stéatose in vitro, fournissant des cellules proliférantes, avec une mort cellulaire accrue et une viabilité inférieure par rapport aux conditions de contrôle. Il convient de mentionner que les sels respectifs de ces acides gras sont disponibles et peuvent également être utilisés. L’un des principaux problèmes lors de l’évaluation de la surcharge lipidique dans la culture de cellules hépatocytaires est donné dans la différenciation entre les modèles toxicologiques et un modèle qui représente le mieux la stéatose. De nombreux modèles peuvent être comptabilisés dans le premier cas. En fait, l’utilisation de l’AP seule pourrait être considérée parmi eux, et la mortalité élevée est le résultat le plus évident^{12,16,23,24,25,26,27}. L’utilisation de doses élevées, même dans le cas de l’arthrose, peut également être considérée comme un modèle toxicologique. Le protocole présenté ici est plus conforme au développement de la stéatose car il montre une faible mortalité par rapport à celle observée dans d’autres modèles et permet de le suivre pendant plusieurs jours avec une accumulation progressive de lipides telle qu’elle se produit dans la NAFLD. La possibilité d’évaluer la stéatose légère et sévère par des conditions expérimentales est considérée comme un autre avantage.

Acides gras	Conditions		Résultats		Référence
PAPA	Concentration : 200 μM		Accumulation de lipides		Yan et al, 201925.
	Temps d’exposition: 24 h		Dommages aux hépatocytes
			Élévation des transaminases
PAPA	Concentration : 50, 100 et 200 μM		Accumulation de lipides		Xing et al, 201924.
	Temps d’exposition: 24 h
PAPA	Concentration : 250 μM, 500 μM, 750 μM et 1 000 μM		Accumulation de lipides		Wang et al, 202026.
	Temps d’exposition: 24 h		Réduction progressive de la viabilité cellulaire
Mélange d’OA/PA	Concentration : 1 mM		Accumulation de lipides		Xiao et al, 202027.
	Temps d’exposition: 24 h		Ne signale pas de lipotoxicité
	Tarif: 2OA:1PA
Mélange d’OA/PA	Première stimulation avec 200 μM et 400 μM de PA, puis deuxième stimulation avec 200 μM d’ARTH		Accumulation de lipides.		Zeng et al, 202012.
	Concentration:400 μM PA: 200 μM OA		Les signes de lipotoxicité induite par l’AP ont été réduits par la stimulation de l’arthrose.
	Tarif: 2PA:1OA
	Temps d’exposition: 24 h
Mélange d’OA/PA	Concentration : 400 μM PA : 200 μM OA		Accumulation de lipides		Chen et al, 201823.
	Tarif: 2PA:1OA
	Temps d’exposition: 24 h
Mélange d’OA/PA	Concentration :50 et 500 μM		Génération de deux types de stéatose: stéatose légère et stéatose sévère.		Campos et Guzmán 2021
	Tarif: 2PA:1OA		Simule l’exposition chronique de la surcharge lipidique
	Temps d’exposition: 24 h, 2 jours, 3 jours et 4 jours.

Tableau 1. Culture d’hépatocytes dans des conditions stéatogènes. Le tableau présente le type d’acide gras utilisé, les conditions maintenues et les résultats observés dans la culture d’hépatocytes. PA : Acide palmitique. OA : Acide oléique.

Enfin, ce modèle est applicable non seulement à l’étude de la stéatose et de la stéatose hépatique, mais aussi aux voies métaboliques hépatiques, synthétiques et de désintoxication dans le contexte de la stéatose. En outre, la stéatose induite in vitro pourrait fournir des preuves pour l’identification de marqueurs potentiels de la maladie ainsi que de cibles thérapeutiques.

Protocol

1. Préparation de milieu standard et conditionné Pour préparer le RPMI 1640 standard, compléter le milieu de culture RPMI 1640 avec 10% (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS, précédemment inactivé par la chaleur) et 1% (v/v) de solution de pénicilline-streptomycine. Conserver le milieu à 4 °C.Stériliser à l’aide de filtres de 0,22 μm. Pour préparer une solution mère de palmitate, préparer une solution de palmitate de 50 mM dans le RPMI 1640 standard préalablement complété par 1% d’a…

Representative Results

Les hépatocytes cultivés dans le milieu stéatogène présentent une croissance sur toute la surface du puits; cependant, les hépatocytes gras présentent un taux de croissance inférieur à celui des cellules cultivées en milieu témoin. Le rapport et la concentration proposés d’arthrose et d’AP garantissent la survie cellulaire pendant la culture. L’ensemencement de 1 x10 5 cellules par puits dans des plaques de 24 puits permet une confluence optimale comme le montre la figure…

Discussion

Ce protocole vise à fournir une stratégie pour étudier la stéatose in vitro. La culture cellulaire est un outil puissant pour étudier les aspects cellulaires, moléculaires, biochimiques et toxicologiques des cellules exposées à différentes conditions. Avec cette approche, la stéatose peut être visualisée non seulement comme un stade de la maladie complexe qu’est la MAFLD, mais aussi comme la surexposition hépatocytaire aux lipides et les résultats possibles résultant d’une telle exposition. Pa…

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.