여기에서 우리는 박테리아에 있는 RIBO-seq를 위한 견본 수집 및 준비의 단계를 기술합니다. 이러한 지침에 따라 준비된 라이브러리의 시퀀싱은 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 생성합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 간단하고 표준 실험실 장비를 사용하며 리시스에서 라이브러리 획득까지 7 일이 걸립니다.
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이 논문에서
요약
초록
리보솜 프로파일링 기법(RIBO-seq)은 현재 생체 내에서단백질 합성 과정을 연구하는 가장 효과적인 도구이다. 이 방법의 장점은 다른 접근법과 비교하여 mRNA 성적 증명서에서 리보솜의 위치와 수를 정확하게 매핑하여 번역을 모니터링할 수 있다는 것입니다.
본 기사에서는 실험의 계획 및 실행과 관련된 세부 사항을 강조하여 박테리아에서 RIBO-seq 방법에 대한 샘플 수집 및 준비의 연속 단계를 설명합니다.
RIBO-seq는 그대로 리보솜 및 관련 mRNAs에 의존하기 때문에, 중요한 단계는 번역의 급속한 억제 및 세포의 적당한 붕괴입니다. 따라서, 우리는 박테리아에서 번역을 체포하는 클로람페니콜과 선택적 전처리와 함께 세포 수확을위한 액체 질소에 여과 및 플래시 동결을 제안한다. 붕괴를 위해, 우리는 기계적으로 세포 벽을 방해하기 위해 알루미늄 산화물의 존재에 박격포와 유봉냉동 세포를 분쇄 제안한다. 이 프로토콜에서, 자당 쿠션 또는 단량 정화를 위한 자당 그라데이션 초원심분리가 필요하지 않다. 대신, 폴리아크릴아미드 겔 전기포고증(PAGE)을 이용한 mRNA 분리가 리보소탈 발자국 절제(28-30 nt band)를 적용하고 만족스러운 결과를 제공한다. 이렇게 하면 메서드가 크게 간소화될 뿐만 아니라 절차에 대한 시간과 장비 요구 사항을 줄일 수 있습니다. 도서관 준비를 위해, 우리는 최적화의 어느 정도 제조 업체의 지침에 따라, 뉴 잉글랜드 생물 연구소에서 일루미나 염기서열에 대한 상업적으로 사용할 수있는 작은 RNA 키트를 사용하는 것이 좋습니다.
생성된 cDNA 라이브러리는 차세대 시퀀싱(NGS)에 필요한 적절한 수량과 품질을 제공합니다. 설명된 프로토콜에 따라 제조된 라이브러리의 시퀀싱은 샘플당 2~10mln고유매핑된 판독으로 포괄적인 생물정보 분석을 위한 충분한 데이터를 제공한다. 우리가 제시하는 프로토콜은 빠르고 상대적으로 쉬우며 표준 실험실 장비로 수행 할 수 있습니다.
서론
리보솜 프로파일링 기법 (RIBO-seq)은 캘리포니아 대학, 샌프란시스코1의조나단 바이스만의 실험실에서 개발되었다. 번역 수준에서 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 다른 방법과 비교하여, RIBO-seq는 mRNA에 각각의 리보솜 결합에 초점을 맞추고 성적 증명서에 리보솜의 위치와 상대적 수에 대한 정보를 제공합니다. 생체 내에서 단백질 합성 공정을 모니터링할 수 있으며 단일 코돈 분해능 및 정확도를 제공하여 개별 mRNA 및 세포 내 전체 전사체를 따라 리보솜 밀도를 측정할 수 있습니다. RIBO-seq 기술의 기초에 리보솜은 mRNA 분자를 결합하고 따라서 ribonuclease 소화에서 녹취록의 매장 된 조각을 보호한다는 사실을 거짓말. 리보나클로스를 첨가하면 보호되지 않은 mRNA가 소화되고 리보솜에 의해 동봉된 파편(일반적으로 ~28-30nt 길이)은 그대로 유지됩니다. 리보솜 발자국(RF)이라고 불리는 이러한 조각들은 리보솜의 정확한 위치를 감지하여 유래한 녹취록에 격리, 시퀀스 및 매핑될 수 있다. 실제로, mRNA 단편을 보호하는 리보솜 능력은 리보솜 결합 및 번역 개시 사이트(TIS)2,3,....
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프로토콜
1. 샘플 컬렉션
- 세균 문화를 준비하십시오. 샘플당 100mL의 배양량을 권장합니다.
- 샘플 수집을 위한 장비 및 시약 준비: 시료 당 스푸뮬라 2개, 멸균 0.45 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 필터, 50mL 멸균 튜브, 액체 질소, 50 mg/mL 클로람페니콜 70% (vol/vol) 에탄올(선택 사항). 액체 질소 증발을 허용하고 폐쇄 튜브의 폭발을 방지하기 위해 50 mL 튜브의 뚜껑을 펑크. 실험실 세제와 70% 에탄올로 스쿠뮬라를 오염 제거합니다.
- 여과 장비와 스쿠쿨라 중 하나를 세균 배양의 성장 온도에 미리 데우지.
참고: 깔때기, 프릿베이스, 접지 조인트 플라스크 및 47mm Ø 스프링 클램프가 있는 올글래스 여과 장치를 추천합니다. - 시료 수확 전에, 100 μg/mL의 최종 농도에 클로람페니콜을 세균 배양에 추가하고 1분(선택 사항)을 배양한다.
- 액체 질소를 50mL 멸균 튜브에 붓고 두 번째 스푸쿨라를 튜브 내부에 배치하여 식힙니다.
주의! 액체 질소는 증발 시 압력 변화로 인해 밀폐 된 용기가 폭발할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 액체 질소 증발을 허용하기 위해 50 mL 튜브의 뚜껑에 몇 개의 구멍을 만들어야합니다. - 여과로 세포를 수....
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결과
여기에 제시된 모범적인 결과는 WT 바실러스 subtilis 세포를 포자하는 번역 규정을 검토하는 연구 결과에서 얻어졌습니다. 야간 배양물은 풍부한 배지의 100mL에서 0.1에 해당하는 OD600으로 희석되었고, 37°C에서 배양하여 OD600이 0.5-0.6에 도달할 때까지 격렬한 흔들림을 하였다. 그 후 풍부한 배지는 포자 공정을 유도하기 위해 최소한의 매체로 대체되었고 인큐베이션은 최대 4시간 동안 계속되었다. 세포는 T0 - 포자 유도로 시작하는 매 시간마다 수확되어 5 개의 시간 점을 초래했습니다. 수확 1 분 전에, 배양은 위의 프로토콜에 설명된 대로 클로람페니콜로 처리되었다. 세포는 0.45 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(MCE) 필터를 사용하여 예열된 유리 여과 시스템에서 여과에 의해 수집되었고 액체 질소에서 플래시 냉동하였다.
용사에서 얻은 리보핵산의 양은 성장 조건, 배양 량 및 밀도에 따라 달라.......
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토론
리보솜 프로파일링의 주요 기술적 과제는 특정 생리학적 인 관심 상태에서 mRNA에 리보솜의 스냅 샷을 캡처하기 위해 번역을 신속하게 억제 할 필요가있다. 이를 달성하기 위해, 번역 억제제, 액체 질소의 신속한 수확 및 플래시 동결이 일반적으로 사용됩니다. 항생제를 적용하는 것은 유물을 일으킬 수 있기 때문에 선택 사항입니다. 클로람페니콜은 세균RIBO-seq에서 길쭉한 리보솜을 체포하기 위해 일반적으로 사용되는 약물입니다. 그러나 개시를 막지 는 못하여 번역 개시사이트(14)의하류에 약 6개의 코돈이 축적되는 것을 방지한다. 더욱이, 펩디딜트랜스퍼라제 반응을 억제하는 능력은 리보소말 P-및 A-사이트 기판의 성질에 의존할 수 있다. 아마도, CAM은 초기 펩티드17,38,50의끝에서 두 번째 아미노산으로 글리, 알라, 세르, Cys, 또는 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
ALS는 EMBO 설치 보조금 IG 3914 및 POIR의 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 04.04.00-00-3E9C/17-00은 유럽 지역 개발 기금에 따라 유럽 연합이 공동 자금을 지원하는 폴란드 과학 재단의 첫 번째 팀 프로그램 내에서 수행되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10X TBE (분말) | Invitrogen | AM9864 | |
| 2-Mercaptoethanol, 99%, 순수 | Acros 유기물 | 125472500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| 알루미늄 산화물 소성 순수 p.a. | Chempur | 114560600 | |
| 염화칼슘 이수화물 | Sigma-Aldrich | C3881-500G | |
| 클로람페니콜 | MP 생물 의학 | 190321 | |
| DNA 클린 & 농축기 -5 | Zymo Research | D4004 | |
| Dnase I 재조합, Rnase-free | Roche | 4716728001 | |
| EDTA 디소듐 염 | Fisher Scientific | E/P140/48 | |
| 에틸 알코올 앱솔루트 99,8% Pure-P.A.-Basic | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | BA6480111 | |
| 여과 장치 | VWR Collection | 511-0265 | 모든 유리 여과 장치, 깔때기, 프릿 베이스, 캡, 47mm Ø 스프링 클램프 및 접지 조인트 플라스크 |
| Gel 40 (19:1) | Rotiphorese | 3030.1 | |
| Gel Loading Dye, Blue, 6X | New England Biolabs | E6138G | |
| 구아노신 5′-[β,γ-imido]트리포스페이트 삼나트륨 염 수화물 | Sigma-Aldrich | G0635-25MG | |
| labZAP | A& 생명 공학 | 040-500 | |
| 마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
| MCE 멤브레인 피터 | Alfatec 기술 | M47MCE45GWS | 기공 크기: 0.45um |
| MICROBExpress 박테리아 mRNA 정제 | Invitrogen | AM1905 | |
| New England Biolabs | E7300S | 용 멀티플렉스 소형 RNA 라이브러리 준비 세트 | |
| 뉴클레아제가 없는 물 | Ambion | AM9937 | |
| 아세트산 칼륨 무수 순수 PA | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 744330113 | |
| Quick-Load pBR322 DNA-MspI 다이제스트 | New England Biolabs | E7323A | |
| RNA Clean & 농축기 -25 | Zymo Research | R1018 | |
| 아세트산 나트륨 | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| 탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | 223530-500G | |
| 탄산수소나트륨 순수 p.a. | POCH Avantor Performance Materials Poland S.A | 810530115 | |
| SYBR Gold 핵산 겔 염색 | Life Technologies | S11494 | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | New England Biolabs | M0201L | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액 | New England Biolabs | B0201S | |
| TBE-Urea 샘플 버퍼(2x) | Invitrogen | LC6876 | |
| 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 초순수, 99,9% | AlfaAesar | J65594 | |
| 트리톤 X-100, 98% | Acros 유기물 | 327371000 | |
| 요소 G.R. | 라흐:NER | 40096-AP0 |
참고문헌
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on t....
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