Cuantificación de las densidades celulares y propiedades antigénicas mediante levitación magnética

Summary

Este artículo describe un método basado en la levitación magnética que puede detectar específicamente la presencia de antígenos, ya sean solubles o unidos a la membrana, cuantificando los cambios en la altura de levitación de las perlas de captura con densidades fijas.

Abstract

El método descrito se desarrolló en base a los principios de la levitación magnética, que separa las células y las partículas en función de su densidad y propiedades magnéticas. La densidad es una propiedad de identificación de tipo celular, directamente relacionada con su tasa metabólica, diferenciación y estado de activación. La levitación magnética permite un enfoque de un solo paso para separar, obtener imágenes y caracterizar con éxito las células sanguíneas circulantes, y para detectar anemia, enfermedad de células falciformes y células tumorales circulantes en función de la densidad y las propiedades magnéticas. Este enfoque también es susceptible de detectar antígenos solubles presentes en una solución mediante el uso de conjuntos de perlas de baja y alta densidad recubiertas con anticuerpos de captura y detección, respectivamente. Si el antígeno está presente en la solución, une los dos conjuntos de perlas, generando un nuevo complejo de cuentas- cuentas, que levitará entre las filas de cuentas recubiertas de anticuerpos. El aumento de la concentración del antígeno objetivo en solución generará un mayor número de complejos de perlas en comparación con concentraciones más bajas de antígeno, lo que permitirá mediciones cuantitativas del antígeno objetivo. La levitación magnética es ventajosa para otros métodos debido a su menor tiempo de preparación de la muestra y la falta de dependencia de los métodos clásicos de lectura. La imagen generada se captura y analiza fácilmente utilizando un microscopio estándar o un dispositivo móvil, como un teléfono inteligente o una tableta.

Introduction

La levitación magnética es una técnica desarrollada para separar, analizar e identificar los tipos celulares^1,2,3,proteínas^4,5 y opioides⁶ basándose únicamente en su densidad específica y propiedades paramagnéticas. La densidad celular es una propiedad única e intrínseca de cada tipo de célula directamente relacionada con su tasa metabólica y estado de diferenciación^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Cuantificar los cambios sutiles y transitorios en la densidad celular durante las condiciones de estado estacionario, y durante una variedad de procesos celulares, podría permitirle a uno una visión inigualable de la fisiología celular y la fisiopatología. Los cambios en la densidad celular se asocian con ladiferenciación celular^15,16,la progresión del ciclo celular^{9,17, 18,19,la apoptosis 20,21,22,23}y la transformación maligna^24,25,26 . Por lo tanto, la cuantificación de cambios específicos en la densidad celular, se puede utilizar para diferenciar entre células de diferentes tipos, así como discriminar entre un mismo tipo de células sometidas a diversos procesos de activación. Esto permite experimentos dirigidos a una subal población celular en particular, donde los cambios dinámicos en la densidad sirven como un indicador del metabolismo celular alterado²⁷. Como se ha establecido que una célula puede alterar su densidad en respuesta a un entorno cambiante^7,es imperativo medir la cinética de la célula en relación con su densidad para entenderla completamente, lo que los métodos actuales pueden no proporcionar¹². La levitación magnética, por otro lado, permite una evaluación dinámica de las células y sus propiedades²⁸.

Las células son diamagnéticas, lo que significa que no tienen un momento dipolar magnético permanente. Sin embargo, cuando se expone a un campo magnético externo, se genera un momento dipolar magnético débil en las células, en la dirección opuesta al campo aplicado. Por lo tanto, si las células están suspendidas en una solución paramagnética y expuestas a un fuerte campo magnético vertical, levitarán lejos de la fuente magnética y se detendrán a una altura, que depende principalmente de su densidad individual. La levitación diamagnética de un objeto confinado al mínimo de un campo magnético no homogéneo es posible cuando se cumplen los dos criterios siguientes: 1) la susceptibilidad magnética de la partícula debe ser menor que la del medio circundante, y 2) la fuerza magnética debe ser lo suficientemente fuerte como para contrarrestar la fuerza de flotabilidad de la partícula. Ambos criterios pueden cumplirse suspendiendo los glóbulos rojos en un búfer magnético y creando fuertes gradientes de campo magnético con imanes permanentes pequeños, económicos y disponibles comercialmente¹. La posición de equilibrio de una partícula atrapada magnéticamente en un eje a lo largo de la dirección de la gravedad está determinada por su densidad (en relación con la densidad del tampón), su susceptibilidad magnética (en relación con la susceptibilidad magnética del tampón) y la firma del campo magnético aplicado. Como la densidad y las propiedades magnéticas de la solución son constantes en todo el sistema, las propiedades de densidad intrínseca de las células serán el factor principal que determine la altura de levitación de las células, con células más densas que levitan más bajas en comparación con las células menos densas. Este enfoque utiliza un conjunto de dos cuentas de referencia de densidad (1,05 y 1,2 g/ml) que nos permite utilizar un análisis preciso y ratiométrico para las mediciones de densidad. Alterar la concentración de la solución magnética permite aislar diferentes poblaciones celulares, como los glóbulos rojos de los glóbulos blancos, ya que la densidad de las células circulantes es específica de la célula, eliminando la necesidad de protocolos de aislamiento u otra manipulación celular.

La mayoría de los métodos de detección utilizados en la investigación biología se basan en la extrapolación de eventos de unión específicos en señales lineales fáciles de cuantificar. Estos métodos de lectura son a menudo complejos e involucran equipos especializados y personal científico dedicado. Aquí se describe un enfoque dirigido a la detección de antígenos que se encuentran en la membrana plasmática de las células o vesículas extracelulares o que son solubles en plasma, utilizando una o dos perlas recubiertas de anticuerpos. Las cuentas deben ser de diferentes densidades entre sí y de las de los objetivos interrogados. La presencia del antígeno objetivo en cualquier biofluido dado se traduce en un cambio específico y medible en la altura de levitación de una célula positiva para antígeno que está unida a una cuenta de detección. En el caso de antígenos solubles o vesículas extracelulares, están unidas tanto a cuentas de captura como de detección, formando un complejo de cuentas-cuentas en lugar de un complejo de perlas-células. El cambio en la altura de levitación depende de la nueva densidad de los complejos de células de cuentas o cuentas. Además del cambio en la altura de levitación de los complejos, que indica la presencia de antígeno en el biofluido, el número de complejos también depende de la cantidad de objetivo, lo que hace que la levitación magnética también sea un enfoque cuantitativo para la detección de antígenos²⁴.

Protocol

El protocolo experimental utilizado en este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Beth Israel Deaconess (IRB). 1. Configuración del instrumento NOTA: Las imágenes de células levitizantes requieren que dos imanes de neodimio de tierras raras magnetizados en el eje Z se coloquen con el mismo polo uno frente al otro para generar un campo magnético. La distancia entre los imanes se puede personalizar dependiendo de la intensid…

Representative Results

La levitación magnética enfoca objetos de diferentes densidades a diferentes alturas de levitación dependiendo de la densidad del objeto, su firma magnética, la concentración de solución paramagnética y la fuerza del campo magnético creado por dos imanes fuertes de tierras raras. Como los dos imanes se colocan uno encima del otro, las muestras que levitan solo se pueden ver, manteniendo la iluminación de Köhler, mediante el uso de un microscopio girado de lado(Figura 1). La altura …

Discussion

La centrifugación por gradiente es actualmente la técnica estándar para aislar componentes subcelulares en función de sus densidades únicas. Este enfoque, sin embargo, requiere el uso de medios de gradiente especializados, así como equipos de centrífuga. El enfoque de levitación magnética presentado aquí permite una investigación detallada de las propiedades morfológicas y funcionales de las células circulantes, con una manipulación mínima, si es que hay alguna, de las células, proporcionando un acceso <e…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube