Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa
Summary
Os esfingolípidos são metabólitos bioativos com papéis bem estabelecidos na doença humana. Caracterizar alterações em tecidos com espectrometria de massa pode revelar papéis na etiologia da doença ou identificar alvos terapêuticos. No entanto, o composto OCT usado para criopreservação em biorrepositórios interfere na espectrometria de massa. Delineamos métodos para analisar esfingolipídios em tecidos humanos incorporados em OCT com LC-ESI-MS/MS.
Abstract
Os esfingolípidos são componentes celulares que têm papéis bem estabelecidos no metabolismo humano e na doença. A espectrometria de massa pode ser usada para determinar se os esfingolipídios estão alterados em uma doença e investigar se os esfingolipídios podem ser direcionados clinicamente. No entanto, estudos prospectivos adequadamente alimentados que adquirem tecidos diretamente do conjunto cirúrgico podem ser demorados e técnico, logístico e administrativamente desafiadores. Em contraste, estudos retrospectivos podem tirar proveito de espécimes humanos criopreservados já disponíveis, geralmente em grande número, em biorrepositórios de tecidos. Outras vantagens de adquirir tecidos de biorrepositórios incluem o acesso a informações associadas aos espécimes de tecido, incluindo histologia, patologia e, em alguns casos, variáveis clínico-patológicas, todas as quais podem ser usadas para examinar correlações com dados lipidômicos. No entanto, limitações técnicas relacionadas à incompatibilidade do composto de temperatura de corte ideal (OCT) utilizado na criopreservação e espectrometria de massas é uma barreira técnica para a análise de lipídios. No entanto, mostramos anteriormente que a OCT pode ser facilmente removida de amostras de biorrepositório humano através de ciclos de lavagens e centrifugação sem alterar seu conteúdo de esfingolipídios. Também estabelecemos anteriormente que os esfingolípidos em tecidos humanos criopreservados em OCT são estáveis por até 16 anos. Neste relatório, descrevemos as etapas e o fluxo de trabalho para analisar esfingolipídios em amostras de tecido humano que estão incorporadas na OCT, incluindo lavagem de tecidos, pesagem de tecidos para normalização de dados, extração de lipídios, preparação de amostras para análise por cromatografia líquida eletrospray ionização em tandem espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS), integração de dados de espectrometria de massa, normalização de dados e análise de dados.
Introduction
Os esfingolípidos são metabólitos bioativos conhecidos por seus papéis no metabolismo humano e na doença 1,2. Regulam processos celulares complexos, como migração celular, sobrevivência e morte celular, movimento celular, tráfico vesicular, invasão e metástase celular, angiogênese e produção de citocinas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defeitos na regulação do metabolismo esfingolipídico contribuem para o início e progressão dos cânceres, determinam o quão agressivos são os cânceres e como os cânceres respondem e desenvolvem resistência à terapia 3,10. Portanto, devido a esses amplos impactos na etiologia da doença, métodos analíticos que possam estabelecer com precisão alterações esfingolipídicas específicas da doença são ferramentas importantes. A espectrometria de massas (EM) é o método mais preciso e confiável para analisar as alterações esfingolipídicas.
Espécimes humanos que podem ser utilizados para a análise de alterações esfingolipídicas podem ser obtidos prospectivamente do conjunto cirúrgico ou retrospectivamente de biorrepositórios teciduais. Tecidos frescos da cirurgia são vantajosos porque podem ser analisados diretamente pela EM ou outros métodos analíticos. No entanto, a aquisição de tecidos prospectivamente tem obstáculos administrativos, técnicos e logísticos, e a coleta de espécimes suficientes para alcançar o poder estatístico pode ser um desafio. A obtenção de tecidos de biorrepositórios é vantajosa porque eles podem ser adquiridos retrospectivamente, em grande número, e os biorrepositórios confirmam histologia e patologia, usam procedimentos operacionais padrão para preservar e armazenar tecidos criogenicamente e podem fornecer dados clínico-patológicos que podem ser usados para análises de correlação. No entanto, para preservar características moleculares e estruturais, os biorrepositórios podem criopreservar tecidos, incorporando-os em composto de temperatura de corte ideal (OCT), que mostramos interferir nos ensaios de normalização de dados e na quantificação de esfingolipídios por cromatografia líquida por espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray por cromatografia líquida (LC-ESI-MS/MS)11 . Também foi demonstrado que o álcool polivinílico e o polietilenoglicol, os componentes primários do composto OCT, resultam em supressão iônica em outras plataformas de análise de SM12,13,14,15. Portanto, o composto OCT deve ser removido dos tecidos antes da análise esfingolipidômica pela EM.
Em um relatório anterior, validamos um protocolo para a remoção de composto OCT de espécimes humanos para análise LC-ESI-MS/MS11 e a metodologia utilizada para pesagem de tecidos para normalização de dados11. Aqui, detalhamos as etapas do protocolo de remoção de compostos OCT esfingolipidômicos (sOCTrP) e mostramos dados representativos de tumores de adenocarcinoma pulmonar humano e tecidos adjacentes normais não envolvidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT é um agente de criopreservação comum a longo prazo usado em biorrepositórios. No entanto, a OCT pode resultar em supressão iônica quando os tecidos são analisados por várias plataformas de espectrometria de massa12,13,14,15, ou resultar em perda de sinal quando as amostras são analisadas por LC-ESI-MS/MS11. A OCT em tecidos criopreservados também pode inter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os serviços e o apoio ao projeto de pesquisa foram fornecidos pelo VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e pelo VCU Lipidomics and Metabolomics Core, que são apoiados em parte com financiamento do NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
