체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석
Summary
이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
Abstract
유도만능줄기세포(iPSC) 및 유전자 편집 기술의 최근 발전으로 표현형 약물 발견(PDD) 프로그램을 위한 새로운 인간 세포 기반 질병 모델을 개발할 수 있습니다. 이러한 새로운 장치는 인간에서 시험용 약물의 안전성과 효능을 보다 정확하게 예측할 수 있지만, 클리닉으로의 개발은 여전히 포유류 데이터, 특히 마우스 질병 모델의 사용에 크게 의존하고 있습니다. 따라서 인간 오가노이드 또는 장기 온 칩 질병 모델과 병행하여 관련 시험관 내 마우스 모델의 개발은 종과 생체 내 및 시험관 내 조건 간의 직접적인 약물 효능 및 안전성 비교를 평가하기 위한 충족되지 않은 요구입니다. 여기에서는 배아체(EB)로 분화된 마우스 배아줄기세포를 활용하는 혈관 발아 분석법을 설명합니다. 3D 콜라겐 젤에 배양된 혈관화된 EB는 확장되는 새로운 혈관을 발달시키는데, 이를 발아 혈관신생이라고 합니다. 이 모델은 내피 팁 세포 선택, 내피 세포 이동 및 증식, 세포 유도, 튜브 형성 및 벽화 세포 모집을 포함하여 기존 혈관 네트워크에서 혈관의 생체 내 발아 혈관 신생의 주요 특징을 요약합니다. 혈관신생을 조절하는 약물 및 유전자를 스크리닝할 수 있으며 인간 iPSC 기술을 기반으로 하는 최근 설명된 3차원(3D) 혈관 분석과 유사성을 보여줍니다.
Introduction
지난 삼십 년 동안 표적 기반 약물 발견(TDD)은 제약 산업의 약물 발견에 널리 사용되었습니다. TDD는 질병에서 중요한 역할을 하는 정의된 분자 표적을 통합하고 약물 스크리닝을 위한 비교적 간단한 세포 배양 시스템 및 판독값의 개발에 의존합니다1. TDD 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 질병 모델에는 암세포 또는 인공 환경 및 비생리학적 기질 내에서 성장한 불멸화된 세포주와 같은 전통적인 세포 배양 방법이 포함됩니다. 이러한 모델 중 다수가 성공적인 약물 후보를 식별하기 위한 실행 가능한 도구를 제공했지만, 질병 관련성이 낮기 때문에 이러한 시스템의 사용은 의심스러울 수 있다2.
대부분의 질병에서 기본 메커니즘은 실제로 복잡하며 다양한 세포 유형, 독립적인 신호 전달 경로 및 여러 유전자 세트가 특정 질병 표현형에 기여하는 것으로 종종 발견됩니다. 이것은 주요 원인이 단일 유전자의 돌연변이인 유전 질환의 경우에도 마찬가지입니다. 최근 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 기술과 유전자 편집 도구의 출현으로 이제 생체 내 인간 복잡성을 더 잘 요약할 수 있는 3D 오가노이드 및 장기 칩 질병 모델을 생성할 수 있습니다 3,4. 이러한 기술의 개발은 표현형 약물 발견(phenotypic drug discovery, PDD) 프로그램에 대한 관심의 부활과 관련이 있다1. PDD는 특정 약물 표적의 정체성에 대한 지식이나 질병에서의 역할에 대한 가설에 의존하지 않기 때문에 경험적 스크리닝과 비교할 수 있습니다. PDD 접근법은 이제 first-in-class 약물 발견에 크게 기여하는 것으로 점점 더 인식되고 있다5. 인간 오가노이드 및 장기 온 칩 기술의 개발은 아직 초기 단계에 있기 때문에 iPSC 모델(혁신적인 이미징 및 기계 학습 도구6,7로 보완됨)은 가까운 장래에 TDD 접근 방식의 낮은 생산성을 극복하기 위해 약물 스크리닝 및 관련 PDD 프로그램을 위한 여러 새로운 복합 세포 기반 질병 모델을 제공할 것으로 예상됩니다8, 9입니다.
인간 오가노이드 및 장기 칩 모델은 질병의 복잡성과 신약 식별에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있지만, 약물을 새로운 임상 실습에 도입하는 것은 효능과 안전성을 평가하기 위해 동물 모델의 데이터에 크게 의존합니다. 그 중에서도 유전자 변형 마우스는 확실히 가장 선호되는 포유류 모델입니다. 그들은 포유류의 생성 시간이 비교적 짧고 인간 질병과 유사한 표현형이 많으며 유전적으로 쉽게 조작할 수 있기 때문에 많은 장점이 있습니다. 따라서 약물 발견 프로그램10에서 광범위하게 사용된다. 그러나 생쥐와 인간 사이의 격차를 해소하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다11. 인간 오가노이드 및 장기 칩 모델과 동등한 시험관 내 마우스 모델의 개발은 생체 내 마우스와 체외 인간 데이터 간의 직접적인 약물 효능 및 안전성 비교를 허용하기 때문에 이 격차를 적어도 부분적으로 채울 수 있습니다.
여기서, 마우스 배아체(EB)의 혈관 발아 분석이 설명됩니다. 혈관은 내피 세포(혈관벽의 내벽), 벽화 세포(혈관 평활근 세포 및 혈관주위세포)로 구성됩니다12. 이 프로토콜은 새로운 내피 세포 및 벽화 세포 분화를 요약하는 매달린 물방울을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포(mESC)를 혈관화된 EB로 분화하는 것을 기반으로 합니다13,14. 마우스 배반포는 상이한 유전적 배경을 갖는 3.5일째 마우스 배반포로부터 배양물에서 쉽게 확립될 수 있다15. 그들은 또한 클론 분석, 혈통 추적에 대한 가능성을 제공하며 질병 모델13,16을 생성하기 위해 유전적으로 쉽게 조작할 수 있습니다.
혈관이 모든 장기에 영양을 공급하기 때문에 전부는 아니더라도 많은 질병이 미세 혈관 구조의 변화와 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 병리학적 상태에서, 내피 세포는 활성화된 상태를 채택하거나 기능 장애를 일으켜 벽화 세포 사멸 또는 혈관으로부터의 이동을 초래할 수 있다. 이들은 과도한 혈관신생 또는 혈관 희박화를 초래할 수 있고, 비정상적인 혈류를 유도할 수 있고, 면역 세포 유출 및 염증을 유발하는 혈관 장벽 결함을 유발할 수 있다12,17,18,19. 따라서 혈관을 조절하는 약물 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며 치료 표적화에 대한 여러 분자 플레이어와 개념이 이미 확인되었습니다. 이러한 맥락에서 설명된 프로토콜은 내피 팁 및 줄기 세포 선택, 내피 세포 이동 및 증식, 내피 세포 안내, 튜브 형성 및 벽화 세포 모집을 포함하여 생체 내 발아 혈관신생의 주요 특징을 요약하기 때문에 질병 모델 구축 및 약물 테스트에 특히 적합합니다. 또한 인간 iPSC 기술20을 기반으로 최근에 기술된 3D 혈관 분석과 유사성을 보여줍니다.
Protocol
1. mESC의 배지 준비 및 배양 보충제를 사용하여 컨디셔닝된 배지 +/-(CM+/-)를 준비합니다. 10%(vol/vol) 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS), 0.05mM β-메르캅토에탄올, 1x 비필수 아미노산(NEAA 1x), 2mM L-글루타민 및 1mM 피루브산나트륨이 포함된 1x Glasgow MEM(G-MEM BHK-1) 배지. 백혈병 억제 인자(LIF)(1,500U/mL) 및 0.1mM β-메르캅토에탄올이 포함된 보충 CM+/- 배지를 사용하여 조건화된 배지 +/+(CM+/+)를 준비합?…
Representative Results
혈관 발아 분석의 프로토콜 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 3개의 독립적인 129/Ola mESC 라인(Z/Red, R1 및 E14)에서 유래한 9일 된 EB를 콜라게나제 A를 사용하여 단일 세포로 효소적으로 해리시켰습니다. 모든 세포주는 강력한 내피 분화를 나타내었고, 내피 세포로 분화하는 능력의 차이는 관찰되지 않았다. 모든 세포주는 내피 세포의 약 10.5% ± 1.3%를 생산하였다(?…
Discussion
이 프로토콜은 혈관신생을 조절하는 약물 및 유전자를 스크리닝할 수 있는 편향되지 않고 강력하며 재현 가능한 3D EB 기반 혈관 발아 분석을 설명합니다. 이 방법은 이동(측면 스크래치 분석 또는 Boyden 챔버 분석)22,23 또는 증식(세포 수 계산, DNA 합성 검출, 증식 마커 검출 또는 대사 분석)24을 모니터링하기 위해 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)와 같은…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Program Marie Skłodowska-Curie COFUND 및 Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
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Cite This Article
Galaris, G., Thalgott, J. H., Teston, E., Lebrin, F. P. In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing. J. Vis. Exp. (171), e62554, doi:10.3791/62554 (2021).