Radioterapia con pittura a dose basata sulla tomografia a emissione di positroni in un modello di ratto glioblastoma utilizzando la piattaforma di ricerca sulle radiazioni dei piccoli animali

Summary

Qui presentiamo un protocollo per eseguire la radioterapia preclinica basata sulla tomografia ad emissione di positroni in un modello di glioblastoma di ratto utilizzando algoritmi sviluppati internamente per ottimizzare l’accuratezza e l’efficienza.

Abstract

In precedenza è stato stabilito un modello di glioblastoma di ratto per imitare il trattamento con radiazioni chemio del glioblastoma umano nella clinica. Analogamente al trattamento clinico, la tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI) sono state combinate durante il processo di pianificazione del trattamento. L’imaging della tomografia ad emissione di positroni (PET) è stato successivamente aggiunto per implementare l’aumento del sottovolume utilizzando un sistema di microirraggiamento. Tuttavia, la combinazione di tre modalità di imaging (TC, RISONANZA MAGNETICA e PET) utilizzando un sistema di microirraggiamento si è rivelata laboriosa perché l’imaging multimodale, la pianificazione del trattamento e la somministrazione della dose devono essere completati sequenzialmente in ambito preclinico. Ciò si traduce anche in un flusso di lavoro più soggetto a errori umani. Pertanto, è stato implementato un algoritmo di facile utilizzo per ottimizzare ulteriormente la pianificazione del trattamento con radiazioni preclinico multimodale basato sull’imaging. Questo strumento software è stato utilizzato per valutare l’accuratezza e l’efficienza della radioterapia con verniciatura a dose con micro-irradiazione utilizzando un progetto di studio in silico . La nuova metodologia per la radioterapia con verniciatura a dose è superiore al metodo precedentemente descritto in termini di accuratezza, efficienza temporale e variabilità intra e interutente. È anche un passo importante verso l’implementazione della pianificazione del trattamento inverso sui microirraggiatori, dove la pianificazione anticipata è ancora comunemente utilizzata, in contrasto con i sistemi clinici.

Introduction

Il glioblastoma (GB) è un tumore cerebrale primario maligno e molto aggressivo. GB è un tumore eterogeneo solido tipicamente caratterizzato da confini infiltrativi, atipia nucleare e ^necrosi1. La presenza della barriera emato-encefalica e lo status del cervello come sito immuno-privilegiato rende la scoperta di nuovi bersagli per la chemio- e l’immunoterapia un compito ^{scoraggiante2,3,4}. È interessante notare che il trattamento dei pazienti con GB è cambiato a malapena dall’introduzione, nel 2005, del protocollo Stupp che combina la radioterapia a fascio esterno (RT) con temozolomide concomitante, di solito seguita da temozolomide adiuvante5. Tipicamente, il protocollo Stupp è preceduto dalla massima resezione chirurgica. Pertanto, gli approcci terapeutici alternativi sono di fondamentale importanza.

L’attuale radioterapia per i pazienti con glioblastoma fornisce una dose di radiazioni uniforme al volume tumorale definito. In radioterapia oncologica, esiste un’importante correlazione dose-risposta per il glioblastoma con dose crescente, che sembra limitarsi a circa 60 Gy, a causa dell’aumentata tossicità per il cervello ^normale6,7. Tuttavia, i tumori possono essere molto (radiobiologicamente) eterogenei, con gradienti di livello di ossigeno e / o grandi differenze nella densità cellulare. Le tecniche di imaging metabolico, come la PET, possono visualizzare queste caratteristiche biologiche e possono essere utilizzate per personalizzare la prescrizione della dose. Questo approccio è noto come dose painting RT. Questo termine è stato introdotto da Ling et al. nel 2000. Gli autori hanno definito la pittura di dose RT come la produzione di “distribuzioni di dose squisitamente conformi entro i vincoli della propagazione e della dispersione delle radiazioni”⁸.

Esistono due tipi di pittura a dose RT, la pittura a dose per contorni (DPBC), con la quale viene prescritta una dose a una serie di sottovolumi nidificati, e la pittura a dose per numeri (DPBN), per cui viene prescritta una dose a livello di voxel. La distribuzione della dose per DPBN RT può essere estratta da immagini funzionali. La dose in ogni voxel è determinata dall’intensità I del voxel corrispondente nell’immagine, con un limite inferiore e superiore, per assicurarsi che, da un lato, venga erogata una dose sufficiente ad ogni parte del tumore. D’altra parte, le dosi non superano un limite superiore per proteggere gli organi a rischio ed evitare la tossicità. Il metodo più semplice è un’interpolazione lineare (vedi Eq. 1) tra la dose minima _Dmin e la dose massima _Dmax, che varia proporzionalmente tra intensità minima _Imax e intensità massima all’interno del volume ^target9,10

Eq. 1

Poiché vi è un certo scetticismo sulla garanzia della qualità di DPBN RT, la deposizione della dose deve essere verificata attraverso la ricerca preclinica e ^clinica10. Tuttavia, solo dati limitati possono essere acquisiti da studi clinici, ed è stato ipotizzato che si possano ottenere maggiori informazioni mediante il downscaling agli animali da ^{laboratorio11,12}. Quindi, gli studi preclinici che utilizzano piattaforme di ricerca sulle radiazioni guidate da immagini di precisione che consentono l’accoppiamento con alcune tecniche molto specifiche, come l’autoradiografia, sono adatti per esaminare questioni aperte e aprire la strada verso la medicina personalizzata e nuove strategie di trattamento, come la pittura della dose ^RT13,14. Tuttavia, l’interpretazione dei dati preclinici deve essere eseguita con cautela e devono essere considerati gli svantaggi di queste configurazioni ^{precliniche14}.

I sistemi di microirraggiamento, come la Small Animal Radiation Research Platform (SARRP), sono dotati di tecnologie simili a quelle della loro controparte clinica. Includono l’imaging CBCT (Cone-beam CT) a bordo, un sistema di pianificazione del trattamento preclinico (PCTPS) e forniscono una precisione sub-millimetrica. I calcoli della dose clinica vengono eseguiti mediante pianificazione inversa del trattamento, in cui si inizia dalla distribuzione della dose desiderata per determinare i fasci tramite un algoritmo iterativo. Gli irradiatori preclinici utilizzano spesso la pianificazione anticipata. Nella pianificazione futura, vengono selezionati la quantità e l’angolo richiesti delle travi e il PCTPS calcola quindi la distribuzione della dose. L’ottimizzazione dei piani viene eseguita mediante iterazione manuale, che richiede molta ^manodopera15.

Dopo il 2009, nuovi sviluppi hanno reso possibile l’implementazione della pianificazione inversa su queste piattaforme ^{di ricerca16,17,18}. Per aumentare la somiglianza con il metodo clinico, è stato sviluppato un collimatore rettangolare variabile motorizzato (MVC) come controparte preclinica del collimatore multi-foglia. Un metodo di pittura a dose bidimensionale che utilizza un collimatore variabile è stato pubblicato da Cho et ^al.19. Questo gruppo di ricerca ha implementato un protocollo tridimensionale (3D) di pianificazione del trattamento inverso su un microirraggiatore e ha determinato dosi minime e massime per il volume target e una dose massima per gli organi a rischio. Queste tecniche sono state valutate principalmente in silico e le loro applicazioni precliniche devono essere esplorate.

Questo documento presenta uno studio in silico per confrontare due metodologie per la verniciatura a base di PET [^18F]-fluoro-etil-L-tirosina ([^18F]FET) in un modello di ratto ^GB20,21,22 utilizzando una piattaforma di ricerca sulle radiazioni di piccoli animali. Queste due metodologie sono (1) l’aumento del sottovolume utilizzando dimensioni del fascio predefinite e (2) la verniciatura della dose utilizzando un collimatore variabile motorizzato in cui le dimensioni della mascella vengono modificate in base all’assorbimento del tracciante PET nel volume tumorale. [^18F] FET è un tracciante PET spesso utilizzato in neuro-oncologia a causa della sua capacità di rilevare tumori ^cerebrali23. [^18F] FET è un amminoacido artificiale che viene internalizzato nelle cellule tumorali ma non incorporato nelle proteine cellulari. [^18F] L’assorbimento del FET corrisponde al tasso di proliferazione cellulare, alla densità delle cellule tumorali e all’angiogenesi24. Poiché questo è il tracciante PET cerebrale oncologico più comunemente usato nell’istituto di questi autori, questo radiotracciante è stato scelto per valutare il nuovo flusso di lavoro.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale per gli esperimenti sugli animali (ECD 18/21). Il monitoraggio dell’anestesia viene eseguito acquisendo la frequenza respiratoria degli animali utilizzando un sensore. 1. Modello di cella di ratto F98 GB Coltivare le cellule F98 GB in un monostrato utilizzando il Modified Eagle Medium di Dulbecco, integrato con il 10% di siero di vitello, l’1% di penicillina, l’1% di streptomicina e l’1% di L-glutammina, e metterle in un incubat…

Representative Results

La fattibilità dell’irradiazione guidata da PET e RISONANZA MAGNETICA in un modello di ratto glioblastoma che utilizza il SARRP per imitare la strategia di trattamento umano è stata precedentemente descritta20,21,22. Mentre l’animale è stato fissato su un letto multimodale realizzato internamente, è stato possibile creare un piano di trattamento con radiazioni accettabile combinando tre modalità di imaging: PET, RISONANZA M…

Discussion

Un modello gb di ratto per imitare il trattamento chemioterapico-radioterapico nella clinica per i pazienti con glioblastoma è stato precedentemente ^descritto20. Analogamente al metodo clinico, la TC e la risonanza magnetica sono state combinate durante il processo di pianificazione del trattamento per ottenere un’irradiazione più precisa. Un letto multimodale per ridurre al minimo il movimento (della testa) è stato utilizzato quando l’animale è stato spostato da un sistema di imaging a un alt…

Materials

Cell culture
F98 Glioblastoma Cell Line	ATCC	CRL-2397	https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-2397
Dulbeco's Modified Eagle Medium	Thermo Fisher Scientific	22320-030
Cell culture flasks	Thermo Fisher Scientific	178883	75 cm²
FBS	Thermo Fisher Scientific	10270106
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-032	200 mM
Penicilline-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-148	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14040-224
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300-062	0.05%
GB Rat Model
Ball-shaped burr	Foredom	A-228	1.8 mm
Bone Wax	Aesculap	1029754	https://www.aesculapusa.com/en/healthcare-professionals/or-solutions/or-solutions-cranial-closure/hemostatic-bone-wax.html
Ethilon	Ethicon	662G/662H	FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm
Fischer F344/Ico crl Rats	Charles River	–
Insulin Syringe Microfine	Beckton-Dickinson	320924	1 mL, 29 G
IR Lamp	Philips	HP3616/01
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	–	2 mg/mL
Micromotor rotary tool	Foredom	K.1090-22
Micropump system	Stoelting Co.	53312	Stoelting Stereotaxic Injector
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51600
Xylocaine (1%, with adrenaline 1:200,000)	Aspen	–	1%, with adrenaline 1:200,000
Xylocaine gel (2%)	Aspen	–	2%
Animal Irradiation
Micro-irradiator	X-Strahl	SARRP	Version 4.2.0
Software	X-Strahl	Muriplan	Preclinical treatment planning system (PCTPC), version 2.2.2
Small Animal PET
[18F]FET	Inhouse made	–	PET tracer; along with Prohance: MRI/PET agent
Micro-PET	Molecubes	Beta-Cube	https://www.molecubes.com/b-cube/
Small Animal MRI
Micro-MRI	Bruker Biospin	Pharmascan 70/16	https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan.html
30 G Needle for IV injection	Beckton-Dickinson	305128
PE 10 Tubing	Instech Laboratories Inc	BTPE-10	BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x 0.024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com
Prohance contrast agent	Bracco Imaging	–	279.3 mg/mL, gadolinium-contrast agent (along with [18F]FET: MRI/PET agent)
Tx/Rx Rat Brain – Mouse Whole Body Volumecoil	Bruker Biospin	–	40 mm diameter
Water-based Heating Unit	Bruker Biospin	MT0125
Consumables
Isoflurane	Zoetis	B506	Anesthesia
Insulin Syringe Microfine	Beckton-Dickinson	320924	1 mL, 29 G
Image Analysis
MATLAB	Mathworks	–	Version R2019b
PMOD	PMOD technologies LLC		Preclinical and molecular imaging software