Immunofenotypering en celsortering van menselijke MKs uit menselijke primaire bronnen of gedifferentieerde in vitro van hematopoëtische voorlopers
Summary
Hier presenteren we een immunofenotyping-strategie voor de karakterisering van megakaryocytdifferentiatie en laten we zien hoe die strategie het sorteren van megakaryocyten in verschillende stadia mogelijk maakt met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder. De methodologie kan worden toegepast op menselijke primaire weefsels, maar ook op megakaryocyten gegenereerd in kweek in vitro.
Abstract
Megakaryocyt (MK) differentiatie omvat een aantal endomitotische cycli die resulteren in een zeer polyploïde (die zelfs >64N) en extreem grote cel (40-60 μm) bereikt. In tegenstelling tot de snel toenemende kennis in megakaryopoiese op celbiologie en moleculair niveau, is de karakterisering van megakaryopoiese door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers, terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. Hier presenteren we een immunofenotypingstrategie die het mogelijk maakt om opeenvolgende MK-differentiatiestadia, met toenemende ploidy-status, te identificeren in menselijke primaire bronnen of in vitro culturen met een panel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert. Ondanks zijn grootte en kwetsbaarheid kunnen MKs worden geïmmunofeerd met behulp van het bovengenoemde paneel en worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering onder specifieke omstandigheden van druk en spuitmonddiameter. Deze aanpak vergemakkelijkt multi-Omics studies, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij mensen beter te begrijpen. Een betere karakterisering van megakaryopoiese kan fundamenteel zijn in de diagnose of prognose van afstammingsgerelateerde pathologieën en maligniteit.
Introduction
Megakaryocyten (MKs) ontwikkelen zich uit hematopoëtische stamcellen (HSC’s) na een complex proces genaamd megakaryopoiese, dat voornamelijk wordt georkestreerd door het hormoon trombopoëtine (TPO). De klassieke kijk op megakaryopoiese beschrijft de cellulaire reis van HSC’s door een opeenvolging van hiërarchische stadia van geëngageerde voorlopers en precursorcellen, wat uiteindelijk leidt tot een volwassen MK. Tijdens de rijping ervaren MKs meerdere rondes van endmitose, ontwikkelen ze een ingewikkeld intracellulair afbakeningsmembraansysteem (DMS), dat voldoende membraanoppervlak biedt voor de productie van bloedplaatjes, en produceren en verpakken efficiënt de overvloed aan factoren die zich in de verschillende korrels bevinden die worden geërfd door volwassen bloedplaatjes1,2,3. Als gevolg hiervan zijn volwassen MKs grote cellen (40-60 μm) die worden gekenmerkt door een zeer polyploïde kern (die zelfs >64N) bereikt. Recente studies suggereren alternatieve routes waarmee HSC ‘s zich onderscheiden in MC ‘s die traditionele lineage commitment checkpoints omzeilen als reactie op bepaalde fysio-pathologische omstandigheden4,5,6,7,8,9,10,11. Deze bevindingen benadrukken dat hematopoëtische differentiatie naar de volwassen MK een continuüm en adaptief proces is dat inspeelt op biologische behoeften.
Met de toenemende kennis over de celbiologie en de moleculaire aspecten die megakaryopoiese12kenmerken, is het grootste deel van het onderzoek gewijd aan de studie van het proces door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers(d.w.z. CD42A/B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. We hebben eerder een strategie gedocumenteerd om megakaryopoiese in muisbeenmerg en beenmerg-afgeleide MK-culturen13,14te fasen , die we hebben aangepast en toegepast op mensen15. In dit artikel tonen we een immunofenotypingstrategie die de karakterisering van megakaryopoiese mogelijk maakt, van HSC’s tot volwassen MC’s, in menselijke primaire bronnen (beenmerg -BM- en perifeer bloed -PB-) of in vitro culturen met behulp van een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert (onder andere CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT en CD71). Ondanks zijn grote omvang en kwetsbaarheid kunnen MKs immunofenotyped worden met behulp van de bovengenoemde celoppervlakmarkers en worden verrijkt door fluorescentiegeactiveerde celsortering onder specifieke druk- en nozzlediameter om celbreuk en/of schade te minimaliseren. Deze techniek vergemakkelijkt multi-Omics benaderingen, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij menselijke gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Opmerkelijk is dat het een nuttig instrument zal zijn om de diagnose en prognose te helpen in een klinische context van groeiende vraag.
In dit manuscript documenteren we een strategie om menselijke megakaryopoiese in scène te plaatsen met een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers uit primaire bronnen integreert of in vitrowordt gegenereerd . Daarnaast bieden we een protocol om te sorteren, met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, de voorkeursfracties en volwassen MKs (Figuur 1). Deze stap is niet populair, omdat het technisch moeilijk is vanwege de grote omvang en kwetsbaarheid van MKs. Het is echter eerder gebruikt in zowel muis- als menselijke beenmergmonsters, en als gevolg van technologische vooruitgang, met telkens een beter resultaat16,17,18. Menselijke primaire bronnen waar MKs of MK precursoren kunnen worden bestudeerd omvatten beenmerg, navelstrengbloed en perifeer bloed, onder andere. De juiste monsterverwerking om de relevante celfractie voor analyse op elk monster te isoleren is van belang. Standaardprocedures zijn opgenomen, met enkele overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het bestuderen van megakaryopoiese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het grootste deel van het onderzoek gericht op de studie van megakaryopoiese door flowcytometrie is tot op heden beperkt tot de identificatie van MK-subsets die alleen afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers gebruiken(d.w.z.CD42A/CD42B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia slecht zijn onderzocht. In dit artikel tonen we een immunofenotyping strategie om een uitgebreide flow cytometrie karakterisering van menselijke megakaryopoiese aan te pakken. Over het algemeen willen we het nut benadrukken van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo en Begoña García Méndez (HUCA) en Paloma Cerezo, Almudena Payero en María de la Poveda-Colomo (HCSC) voor de technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Medical Grants (Roche SP200221001) aan A.B., een RYC fellowship (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje) en een I+D 2017-subsidie (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanje en Fondos FEDER) aan L.G., een Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanje) naar P.M.-B. en een intramurale postdoctorale subsidie 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spanje) aan A.A.-H. Wij danken Reinier van der Linden voor het delen van zijn kennis (en tijd), met name zijn wijze advies over multi-color tagged-antibody panel mix en single-color kraalcontrole voorbereiding.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
