Immunofenotyping og cellesortering av menneskelige MKs fra humane primærkilder eller differensiert in vitro fra hematopoietiske forfedre
Summary
Her presenterer vi en immunofenotypingsstrategi for karakterisering av megakaryocyttdifferensiering, og viser hvordan denne strategien tillater sortering av megakaryocytter på forskjellige stadier med en fluorescensaktivert cellesortering. Metodikken kan brukes på humant primærvev, men også på megakaryocytter generert i kultur in vitro.
Abstract
Megakaryocytt (MK) differensiering omfatter en rekke endomitotiske sykluser som resulterer i en svært polyploid (når enda >64N) og ekstremt stor celle (40-60 μm). I motsetning til den raskt økende kunnskapen i megakaryopoiesis på cellebiologi og molekylært nivå, er karakteriseringen av megakaryopoiesis ved strømningscytometri begrenset til identifisering av modne MKs ved hjelp av avstamningsspesifikke overflatemarkører, mens tidligere MK-differensieringsstadier forblir uutforskede. Her presenterer vi en immunofenotypingsstrategi som gjør det mulig å identifisere påfølgende MK-differensieringsstadier, med økende ploidystatus, i menneskelige primære kilder eller in vitro-kulturer med et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører. Til tross for størrelsen og skjørheten kan MKs immunofenotypes ved hjelp av det ovennevnte panelet og berikes av fluorescensaktivert cellesortering under bestemte forhold med trykk- og dysediameter. Denne tilnærmingen letter multi-Omics studier, med sikte på å bedre forstå kompleksiteten i megakaryopoiesis og blodplateproduksjon hos mennesker. En bedre karakterisering av megakaryopoiesis kan utgjøre grunnleggende i diagnosen eller prognosen for avstamningsrelaterte patologier og malignitet.
Introduction
Megakaryocytter (MKs) utvikler seg fra hematopoietiske stamceller (HSC) etter en kompleks prosess kalt megakaryopoiesis, som er orkestrert hovedsakelig av hormonet trombopoietin (TPO). Den klassiske utsikten over megakaryopoiesis beskriver den cellulære reisen fra HSC gjennom en rekke hierarkiske stadier av engasjerte forfedre og forløperceller, noe som til slutt fører til en moden MK. Under modning opplever MKs flere runder med endomitose, utvikler et intrikat intracellulært avgrensningsmembransystem (DMS), som gir nok membranoverflate til blodplateproduksjon, og produserer og pakker effektivt mengden faktorer som finnes i de forskjellige granulatene arvet av modne blodplater1,2,3. Som et resultat er modne MKs store celler (40-60 μm) preget av en svært polyploid kjerne (når enda >64N). Nyere studier antyder alternative ruter der HSC skiller seg ut i MK-er som omgår tradisjonelle avstamningsforpliktelseskontroller som svar på visse fysio-patologiske forhold4,5,6,7,8,9,10,11. Disse funnene fremhever at hematopoietisk differensiering mot den modne MK er en kontinuums- og adaptiv prosess som responderer på biologiske behov.
Med den økende kunnskapen om cellebiologien og de molekylære aspektene som karakteriserer megakaryopoiesis12, er det meste av forskningen dedikert til studiet av prosessen ved flowcytometri begrenset til identifisering av modne MKs ved hjelp av avstamningsspesifikke overflatemarkører (dvs. CD42A / B, CD41 / CD61), mens tidligere MK-differensieringsstadier forblir uutforskede. Vi har tidligere dokumentert en strategi for å iscenesette megakaryopoiesis i musebenmarg og benmargsavledede MK-kulturer13,14, som vi har tilpasset og brukt på mennesker15. I den nåværende artikkelen viser vi en immunofenotypingsstrategi som gjør det mulig å karakterisere megakaryopoiesis, fra HSC-er til modne MKs, i menneskelige primære kilder (benmarg -BM- og perifert blod -PB-) eller in vitrokulturer ved hjelp av et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT og CD71, blant andre). Til tross for sin store størrelse og skjørhet, kan MKs immunofenotypes ved hjelp av ovennevnte celleoverflatemarkører og berikes av fluorescensaktivert cellesortering under bestemte forhold med trykk- og dysediameter for å minimere cellebrudd og / eller skade. Denne teknikken letter multi-Omics tilnærminger, med sikte på å bedre forstå kompleksiteten av megakaryopoiesis og blodplateproduksjon i menneskers helse og sykdom. Bemerkelsesverdig vil det utgjøre et nyttig verktøy for å hjelpe diagnose og prognose i en klinisk sammenheng med økende etterspørsel.
I dette manuskriptet dokumenterer vi en strategi for å iscenesette menneskelige megakaryopoiesis med et panel som integrerer MK-spesifikke og ikke-spesifikke overflatemarkører fra primære kilder eller generert in vitro. I tillegg tilbyr vi en protokoll for sortering, med en fluorescensaktivert cellesortering, de foretrukne fraksjonene og modne MK-er (figur 1). Dette trinnet er ikke populært, da det er teknisk vanskelig på grunn av den store størrelsen og skjørheten til MKs. Imidlertid har den blitt brukt både i muse- og menneskelige benmargsprøver tidligere, og på grunn av teknologisk fremgang, med et bedre resultat hver gang16,17,18. Menneskelige primærkilder der MKs eller MK forløpere kan studeres inkluderer blant annet benmarg, ledningsblod og perifert blod. Riktig prøvebehandling for å isolere den relevante cellefraksjonen for analyse på hvert utvalg er viktig. Standardprosedyrer er innlemmet, med noen hensyn å ta når man tar sikte på studiet av megakaryopoiesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det meste av forskningen som fokuserer på studiet av megakaryopoiesis ved flowcytometri er til dags dato begrenset til identifisering av MK-delsett ved hjelp av bare avstamningsspesifikke overflatemarkører (dvs.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), mens tidligere MK-differensieringsstadier har blitt dårlig undersøkt. I den nåværende artikkelen viser vi en immunofenotyping strategi for å adressere en omfattende strømning cytometri karakterisering av menneskelig megakaryopoiesis. Totalt sett vil vi fremheve nytten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo og Begoña García Méndez (HUCA) og Paloma Cerezo, Almudena Payero og María de la Poveda-Colomo (HCSC) for teknisk støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Medical Grants (Roche SP200221001) til A.B., et RYC-stipend (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spania) og et I+D 2017-stipend (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spania og Fondos FEDER) til L.G., en Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spania) til P.M.-B. og et intramuralt postdoktorstipend 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spania) til A.A.-H. Vi takker Reinier van der Linden for å ha delt sin kunnskap (og tid), spesielt hans kloke råd om flerfarget tagged-antistoff panel blanding og single-color perle kontroll forberedelse.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
