הערכת תגובות חיסוניות נשימתיות לשפעת המופילוס
Summary
המופילוס אינפלואנזה משרה דלקת בדרכי הנשימה. מאמר זה יתמקד בשימוש בציטומטריה של זרימה ובמיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להגדיר תגובות חיסוניות של פאגוציטים ולימפוציטים בתגובה לחיידק זה.
Abstract
המופילוס אינפלואנזה (Hi) הוא חיידק נפוץ המצוי במגוון מצבים נשימתיים. ניתן להשתמש במגוון מבחנים/טכניקות שונות כדי להעריך את התגובה החיסונית/דלקתית הנשימתית לחיידק זה. ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית הן טכנולוגיות מבוססות פלואורסצנציה המאפשרות אפיון מפורט של תגובות ביולוגיות. ניתן להשתמש בצורות שונות של אנטיגן Hi, כולל רכיבי דופן התא, תכשירים מומתים/מושתקים וחיידקים חיים. היי הוא חיידק חזק הדורש מדיה מועשרת אך בדרך כלל קל לגדל אותו בסביבות מעבדה סטנדרטיות. דגימות רקמה לגירוי עם Hi עשויות להתקבל מדם היקפי, ברונכוסקופיה או ריאה כריתה (למשל, בחולים העוברים ניתוח לטיפול בסרטן ריאות). ניתן להעריך באופן מקיף את תפקוד המקרופאגים והנויטרופילים באמצעות ציטומטריה של זרימה עם מגוון פרמטרים שנמדדו, כולל פאגוציטוזה, מיני חמצן תגובתי וייצור ציטוקינים תוך-תאיים. ניתן להעריך באופן ספציפי את תפקוד הלימפוציטים (לדוגמה, תפקוד תאי T ותאי NK) באמצעות ציטומטריית זרימה, בעיקר לייצור ציטוקינים תוך-תאיים. זיהום היי הוא גורם רב עוצמה לייצור מלכודות חוץ-תאיות, הן על ידי נויטרופילים (NETs) והן על ידי מקרופאגים (METs). מיקרוסקופיה קונפוקלית היא ללא ספק הדרך האופטימלית ביותר להעריך ביטוי NET ו- MET, אשר עשוי לשמש גם להערכת פעילות פרוטאזות. ניתן להעריך את חסינות הריאות להמופילוס אינפלואנזה באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
Introduction
שפעת המופילוס (Hi) היא חיידק קומנסלי רגיל הנמצא בלוע של רוב המבוגרים הבריאים. היי יכולה להיות בעלת קפסולת רב-סוכר (סוגים A-F, למשל, סוג B או HiB) או חסרת קפסולה ואינה ניתנת להקלדה (NTHi)1. קולוניזציה של הרירית עם חיידק זה מתחילה בילדות המוקדמת, ויש תחלופה של זנים מתיישבים שונים2. חיידק זה מסוגל גם לפלישה של דרכי הנשימה העליונות והתחתונות; בהקשר זה, הוא עשוי לגרום להפעלת התגובה החיסונית ולדלקת 3,4. תגובה דלקתית זו עלולה לגרום למחלות קליניות ולתרום למגוון מצבים נשימתיים חשובים, כולל סינוסיטיס, דלקת אוזניים, ברונכיטיס, סיסטיק פיברוזיס, דלקת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). רוב התנאים האלה נובעים מזנים NTHi2. מאמר זה יתאר שיטות להערכת תגובות חיסוניות נשימתיות ל-Hi באמצעות ציטומטריה של זרימה ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
השיטות המתוארות להלן הותאמו מטכניקות מבוססות היטב ששונו כדי להעריך את התגובה הדלקתית ל- Hi. הבחירה של צורה אנטיגנית מתאימה של היי היא חלק מרכזי בהערכה זו. תכשירים אנטיגניים נעים בין רכיבי דופן התא לחיידקים חיים. כדי לקבוע ולתקנן בדיקות, השימוש בדגימות דם היקפיות עשוי להיות מועיל מאוד בהתחלה.
ציטומטריה של זרימה מאפשרת מדידה של מגוון פרמטרים ומבחנים פונקציונליים מדגימה אחת ברמה התאית. לטכניקה זו יש יתרון בכך שניתן להעריך תגובות תאיות ספציפיות (למשל, ייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) או ייצור ציטוקינים תוך-תאיים) בהשוואה לשיטות כלליות יותר אחרות כגון בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA) או ELISspot.
מלכודות חוץ-תאיות מבוטאות על-ידי נויטרופילים (NETs)5,6,7 ועל-ידי תאים אחרים כגון מקרופאגים (METs)8. הם מזוהים יותר ויותר כתגובה דלקתית מרכזית, במיוחד בזיהום בריאה9. הם עשויים להיות מוערכים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי סופי של NETs/METs ומבדילה את הביטוי שלהם מצורות אחרות של מוות תאי6.
גם ציטומטריה של זרימה וגם מיקרוסקופיה קונפוקלית הן בדיקות מבוססות פלואורסצנציה. הצלחתם תלויה בפרוטוקולי מאמץ אופטימליים של דגימות ביולוגיות. שיטות אלה אכן לוקחות קצת זמן ללמוד ודורשות מומחיות פיקוח מתאימה. המכשירים המעורבים הם גם יקרים הן לרכישה והן להפעלה. ההגדרה האופטימלית לשימושם כוללת אוניברסיטאות גדולות ובתי חולים להפניה שלישונית.
השיטות המשמשות בפרוטוקול זה ניתנות להעברה לחקר אורגניזמים דומים אחרים המעורבים במחלות בדרכי הנשימה (למשל, מוקסרלה קטרליס ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס). NTHi גם אינטראקציה עם חיידקים נשימתיים נפוצים אחרים10.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המפורטות כאן משתמשות בציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנציה ובטכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית שניתן להשתמש בהן בשילוב כדי לקבל מידע מפורט על תגובת הריאות הדלקתית ל-Hi.
קביעת הנוסחה האנטיגנית המתאימה של Hi לשימוש היא קריטית, ורצוי לקבל קלט ספציפי ממיקרוביולוג בהקשר זה. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות של אימונולוגיה קלינית ב- Monash Health על עזרתם בעבודה זו.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
