हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा के लिए श्वसन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन
Summary
हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा श्वसन पथ में सूजन लाता है। यह लेख इस जीवाणु के जवाब में फागोसाइट्स और लिम्फोसाइटों द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करेगा।
Abstract
हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा (एचआई) एक प्रचलित जीवाणु है जो श्वसन स्थितियों की एक श्रृंखला में पाया जाता है। इस जीवाणु के लिए श्वसन प्रतिरक्षा / भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए विभिन्न परखों / तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति-आधारित प्रौद्योगिकियां हैं जो जैविक प्रतिक्रियाओं के विस्तृत लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं। हाय एंटीजन के विभिन्न रूपों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें सेल दीवार घटक, मारे गए / निष्क्रिय तैयारी और जीवित बैक्टीरिया शामिल हैं। हाय एक तेज़ जीवाणु है जिसे समृद्ध मीडिया की आवश्यकता होती है लेकिन आमतौर पर मानक प्रयोगशाला सेटिंग्स में बढ़ना आसान होता है। हाय के साथ उत्तेजना के लिए ऊतक के नमूने परिधीय रक्त, ब्रोंकोस्कोपी, या निकाले गए फेफड़े (जैसे, फेफड़ों के कैंसर के इलाज के लिए सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों में) से प्राप्त किए जा सकते हैं। मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन को विभिन्न मापदंडों के साथ प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके व्यापक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जिसमें फागोसाइटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां और इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन शामिल हैं। लिम्फोसाइट फ़ंक्शन (जैसे, टी सेल और एनके सेल फ़ंक्शन) को विशेष रूप से फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन के लिए। हाय संक्रमण न्यूट्रोफिल (एनईटी) और मैक्रोफेज (एमईटी) दोनों द्वारा बाह्य जाल उत्पादन का एक शक्तिशाली प्रेरक है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यकीनन नेट और एमईटी अभिव्यक्ति का आकलन करने का सबसे इष्टतम तरीका है, जिसका उपयोग प्रोटीज गतिविधि का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है। हेमोफिलस इन्फ्लूएंजा के लिए फेफड़ों की प्रतिरक्षा का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।
Introduction
हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा (हाय) एक सामान्य कॉमेंसल जीवाणु है जो अधिकांश स्वस्थ वयस्कों के ग्रसनी में मौजूद है। हाय में एक पॉलीसेकेराइड कैप्सूल (प्रकार ए-एफ, जैसे, टाइप बी या एचआईबी) हो सकता है या कैप्सूल की कमी हो सकती है और नॉनटाइपेबल (एनटीएचआई)1 हो सकता है। इस जीवाणु के साथ म्यूकोसा का औपनिवेशीकरण बचपन में शुरू होता है, और विभिन्न उपनिवेश उपभेदों का कारोबार होताहै। यह जीवाणु ऊपरी और निचले श्वसन पथ दोनों के आक्रमण में भी सक्षम है; इस संदर्भ में, यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और सूजन3,4 के सक्रियण को प्रेरित कर सकता है। यह भड़काऊ प्रतिक्रिया नैदानिक बीमारी का कारण बन सकती है और साइनसाइटिस, ओटिटिस मीडिया, ब्रोंकाइटिस, सिस्टिक फाइब्रोसिस, निमोनिया और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) सहित विभिन्न महत्वपूर्ण श्वसन स्थितियों में योगदान कर सकती है। इनमें से अधिकांश स्थितियां एनटीएचआई उपभेदों2 के कारण हैं। यह लेख फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हाय के लिए श्वसन प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करेगा।
नीचे वर्णित विधियों को अच्छी तरह से स्थापित तकनीकों से अनुकूलित किया गया है जिन्हें हाय के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए संशोधित किया गया है। हाय के एक उपयुक्त एंटीजेनिक रूप का चयन इस मूल्यांकन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। एंटीजेनिक तैयारी सेल दीवार घटकों से लेकर जीवित बैक्टीरिया तक होती है। परख स्थापित करने और मानकीकृत करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों का उपयोग शुरू में बहुत उपयोगी हो सकता है।
फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर स्तर पर एक नमूने से विभिन्न मापदंडों और कार्यात्मक परखों के माप को सक्षम बनाता है। इस तकनीक का लाभ यह है कि एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) या ईएलआईस्पॉट जैसे अन्य अधिक सामान्य तरीकों की तुलना में विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं (जैसे, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) या इंट्रासेल्युलर साइटोकिन उत्पादन का उत्पादन) का मूल्यांकन किया जा सकता है।
एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप न्यूट्रोफिल (एनईटी) 5,6,7 और मैक्रोफेज (एमईटी) 8 जैसे अन्य कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए जाते हैं। वे तेजी से एक महत्वपूर्ण भड़काऊ प्रतिक्रिया के रूप में पहचाने जाते हैं, खासकर फेफड़ों में संक्रमणमें 9। उनका मूल्यांकन कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। यह तकनीक एनईटी / एमईटी की निश्चित पहचान की अनुमति देती है और उनकी अभिव्यक्ति को कोशिका मृत्यु के अन्य रूपों से अलग करतीहै।
फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दोनों फ्लोरेसेंस-आधारित परख हैं। उनकी सफलता जैविक नमूनों के इष्टतम तनाव प्रोटोकॉल पर निर्भर है। इन विधियों को सीखने में कुछ समय लगता है और उचित पर्यवेक्षण विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसमें शामिल उपकरण खरीदने और चलाने दोनों के लिए महंगे हैं। उनके उपयोग के लिए इष्टतम सेटिंग में प्रमुख विश्वविद्यालय और तृतीयक रेफरल अस्पताल शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली विधियां श्वसन रोग में शामिल अन्य समान जीवों के अध्ययन के लिए हस्तांतरणीय हैं (उदाहरण के लिए, मोक्सारेला कैटरहालिस और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया)। एनटीएचआई अन्य सामान्य श्वसन बैक्टीरिया10 के साथ भी बातचीत करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां सूचीबद्ध विधियां फ्लोरेसेंस-आधारित फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करती हैं जिनका उपयोग हाय के लिए भड़काऊ फेफड़ों की प्रतिक्रिया के बारे में विस्तृत जानकारी प्रा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस काम के साथ उनकी सहायता के लिए मोनाश हेल्थ में क्लिनिकल इम्यूनोलॉजी के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
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