Оценка респираторных иммунных реакций на Haemophilus Influenzae
Summary
Haemophilus influenzae вызывает воспаление в дыхательных путях. Эта статья будет посвящена использованию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии для определения иммунных реакций фагоцитов и лимфоцитов в ответ на эту бактерию.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) является распространенной бактерией, обнаруженной в ряде респираторных заболеваний. Различные анализы / методы могут быть использованы для оценки респираторного иммунного / воспалительного ответа на эту бактерию. Проточная цитометрия и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными технологиями, которые позволяют детально характеризовать биологические реакции. Могут быть использованы различные формы антигена Hi, включая компоненты клеточной стенки, убитые / инактивированные препараты и живые бактерии. Hi – это привередливая бактерия, которая требует обогащенных сред, но, как правило, легко выращивается в стандартных лабораторных условиях. Образцы тканей для стимуляции Hi могут быть получены из периферической крови, бронхоскопии или резецированного легкого (например, у пациентов, перенесших операцию по лечению рака легких). Функция макрофагов и нейтрофилов может быть всесторонне оценена с использованием проточной цитометрии с различными измеренными параметрами, включая фагоцитоз, активные формы кислорода и внутриклеточную продукцию цитокинов. Функция лимфоцитов (например, функция Т-клеток и NK-клеток) может быть специально оценена с помощью проточной цитометрии, главным образом для внутриклеточной продукции цитокинов. Hi-инфекция является мощным индуктором внеклеточной ловушки, как нейтрофилами (NETs), так и макрофагами (METs). Конфокальная микроскопия, возможно, является наиболее оптимальным способом оценки экспрессии NET и MET, который также может быть использован для оценки активности протеазы. Иммунитет легких к Haemophilus influenzae можно оценить с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) является нормальной комменсальной бактерией, присутствующей в глотке большинства здоровых взрослых. Hi может иметь полисахаридную капсулу (типы A-F, например, тип B или HiB) или не иметь капсулы и быть нетипируемым (NTHi)1. Колонизация слизистой этой бактерией начинается в раннем детстве, и происходит оборот различных колонизирующих штаммов2. Эта бактерия также способна к инвазии как в верхние, так и в нижние дыхательные пути; в этом контексте он может вызвать активацию иммунного ответа и воспаление 3,4. Эта воспалительная реакция может вызвать клиническое заболевание и способствовать различным важным респираторным заболеваниям, включая синусит, средний отит, бронхит, муковисцидоз, пневмонию и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Большинство из этих состояний обусловлены штаммами NTHi2. В этой статье будут описаны методы оценки респираторных иммунных реакций на Hi с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.
Методы, описанные ниже, были адаптированы из хорошо зарекомендовавших себя методов, которые были модифицированы для оценки воспалительной реакции на Hi. Выбор подходящей антигенной формы Hi является ключевой частью этой оценки. Антигенные препараты варьируются от компонентов клеточной стенки до живых бактерий. Для установления и стандартизации анализов использование образцов периферической крови может быть очень полезным на начальном этапе.
Проточная цитометрия позволяет измерять различные параметры и функциональные анализы из одного образца на клеточном уровне. Этот метод имеет то преимущество, что специфические клеточные реакции (например, производство активных форм кислорода (АФК) или внутриклеточная продукция цитокинов) могут быть оценены по сравнению с другими более общими методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) или ELISspot.
Внеклеточные ловушки экспрессируются нейтрофилами (NETs)5,6,7 и другими клетками, такими как макрофаги (METs)8. Они все чаще признаются в качестве ключевой воспалительной реакции, особенно при инфекции в легких9. Они могут быть оценены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет окончательно идентифицировать НЭТ/МЕТ и отличает их экспрессию от других форм гибели клеток6.
Как проточная цитометрия, так и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными анализами. Их успех зависит от оптимальных протоколов процеживания биологических образцов. Эти методы занимают некоторое время для изучения и требуют соответствующего надзорного опыта. Задействованные инструменты также дороги как для покупки, так и для запуска. Оптимальная среда для их использования включает в себя крупные университеты и третичные специализированные больницы.
Методы, используемые в этом протоколе, переносятся для изучения других подобных организмов, участвующих в респираторных заболеваниях (например, Moxarella catarrhalis и Streptococcus pneumoniae). NTHi также взаимодействует с другими распространенными респираторными бактериями10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, перечисленные здесь, используют флуоресцентную проточную цитометрию и методы конфокальной микроскопии, которые могут быть использованы в сочетании для получения подробной информации о воспалительной реакции легких на Hi.
Установление соответствующей антигенн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии Monash Health за помощь в этой работе.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
