Bedömning av respiratoriska immunsvar mot Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae inducerar inflammation i luftvägarna. Denna artikel kommer att fokusera på användningen av flödescytometri och konfokalmikroskopi för att definiera immunsvar av fagocyter och lymfocyter som svar på denna bakterie.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) är en utbredd bakterie som finns i en rad andningsbesvär. En mängd olika analyser/tekniker kan användas för att bedöma det respiratoriska immuna/inflammatoriska svaret på denna bakterie. Flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade tekniker som möjliggör detaljerad karakterisering av biologiska svar. Olika former av Hi-antigen kan användas, inklusive cellväggskomponenter, dödade / inaktiverade preparat och levande bakterier. Hej är en krånglig bakterie som kräver berikade medier men är i allmänhet lätt att odla i vanliga laboratoriemiljöer. Vävnadsprover för stimulering med Hi kan erhållas från perifert blod, bronkoskopi eller resekterad lunga (t.ex. hos patienter som genomgår kirurgi för behandling av lungcancer). Makrofag och neutrofil funktion kan utvärderas omfattande med hjälp av flödescytometri med en mängd olika parametrar uppmätta, inklusive fagocytos, reaktiva syrearter och intracellulär cytokinproduktion. Lymfocytfunktionen (t.ex. T-cells- och NK-cellfunktion) kan bedömas specifikt med hjälp av flödescytometri, främst för intracellulär cytokinproduktion. Hi-infektion är en potent inducerare av extracellulär fällproduktion, både av neutrofiler (NET) och makrofager (METs). Konfokalmikroskopi är utan tvekan det mest optimala sättet att bedöma NET- och MET-uttryck, som också kan användas för att bedöma proteasaktivitet. Lungimmunitet mot Haemophilus influenzae kan bedömas med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) är en normal kommensal bakterie som finns i svalget hos de flesta friska vuxna. Hi kan ha en polysackaridkapsel (typ A-F, t.ex. typ B eller HiB) eller sakna kapsel och vara icke-skrivbar (NTHi)1. Kolonisering av slemhinnan med denna bakterie börjar i tidig barndom, och det finns en omsättning av olika koloniserande stammar2. Denna bakterie kan också invasionen av både övre och nedre luftvägarna; I detta sammanhang kan det inducera aktivering av immunsvaret och inflammation 3,4. Detta inflammatoriska svar kan orsaka klinisk sjukdom och bidra till en mängd viktiga andningsbesvär, inklusive bihåleinflammation, otitis media, bronkit, cystisk fibros, lunginflammation och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). De flesta av dessa förhållanden beror på NTHi-stammar2. Denna artikel kommer att beskriva metoder för att bedöma respiratoriska immunsvar mot Hi med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs nedan har anpassats från väletablerade tekniker som har modifierats för att bedöma det inflammatoriska svaret på Hi. Valet av en lämplig antigenform av Hi är en viktig del av denna bedömning. Antigena preparat sträcker sig från cellväggskomponenter till levande bakterier. För att upprätta och standardisera analyser kan användningen av perifera blodprover vara till stor hjälp initialt.
Flödescytometri möjliggör mätning av en mängd olika parametrar och funktionella analyser från ett prov på cellulär nivå. Denna teknik har fördelen att specifika cellulära svar (t.ex. produktion av reaktiva syrearter (ROS) eller intracellulär cytokinproduktion) kan bedömas jämfört med andra mer allmänna metoder såsom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) eller ELISspot.
Extracellulära fällor uttrycks av neutrofiler (NET)5,6,7 och av andra celler såsom makrofager (METs)8. De erkänns alltmer som ett viktigt inflammatoriskt svar, särskilt vid infektion i lungan9. De kan bedömas med konfokal fluorescensmikroskopi. Denna teknik möjliggör definitiv identifiering av NET/METs och skiljer deras uttryck från andra former av celldöd6.
Både flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade analyser. Deras framgång är beroende av optimala töjningsprotokoll för biologiska prover. Dessa metoder tar lite tid att lära sig och kräver lämplig övervakningsexpertis. De inblandade instrumenten är också dyra både att köpa och driva. Den optimala inställningen för deras användning inkluderar stora universitet och tertiära remisssjukhus.
Metoderna som används i detta protokoll är överförbara för studier av andra liknande organismer som är involverade i andningssjukdomar (t.ex. Moxarella catarrhalis och Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerar också med andra vanliga andningsbakterier10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna som listas här använder fluorescensbaserad flödescytometri och konfokalmikroskopitekniker som kan användas tillsammans för att få detaljerad information om det inflammatoriska lungsvaret på Hi.
Att fastställa lämplig antigenformulering av Hi som ska användas är avgörande, och det är lämpligt att ha specifik input från en mikrobiolog i detta avseende. Live Hi inducerar ett starkare svar, medan dödade Hi-preparat och Hi-komponenter är mer standardiserade och är lätta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka personalen på Clinical Immunology på Monash Health för deras hjälp med detta arbete.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
