Vurdering af respiratoriske immunresponser på Haemophilus influenzae
Summary
Haemophilus influenzae inducerer betændelse i luftvejene. Denne artikel vil fokusere på brugen af flowcytometri og konfokal mikroskopi til at definere immunrespons af fagocytter og lymfocytter som reaktion på denne bakterie.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) er en udbredt bakterie, der findes i en række luftvejssygdomme. En række forskellige assays / teknikker kan anvendes til at vurdere respiratorisk immun / inflammatorisk respons på denne bakterie. Flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede teknologier, der muliggør detaljeret karakterisering af biologiske reaktioner. Forskellige former for Hi-antigen kan anvendes, herunder cellevægskomponenter, dræbte / inaktiverede præparater og levende bakterier. Hej er en kræsen bakterie, der kræver berigede medier, men er generelt let at dyrke i standard laboratorieindstillinger. Vævsprøver til stimulering med Hi kan fås fra perifert blod, bronkoskopi eller resekteret lunge (f.eks. Hos patienter, der gennemgår kirurgi til behandling af lungekræft). Makrofag og neutrofilfunktion kan vurderes grundigt ved hjælp af flowcytometri med en række parametre målt, herunder fagocytose, reaktive iltarter og intracellulær cytokinproduktion. Lymfocytfunktion (f.eks. T-celle- og NK-cellefunktion) kan vurderes specifikt ved hjælp af flowcytometri, hovedsageligt til intracellulær cytokinproduktion. Hi-infektion er en potent inducer af ekstracellulær fældeproduktion, både af neutrofiler (NET’er) og makrofager (MET’er). Konfokal mikroskopi er uden tvivl den mest optimale måde at vurdere NET- og MET-ekspression på, som også kan bruges til at vurdere proteaseaktivitet. Lungeimmunitet over for Haemophilus influenzae kan vurderes ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) er en normal kommensal bakterie til stede i svælget hos de fleste raske voksne. Hej kan have en polysaccharidkapsel (type A-F, f.eks. type B eller HiB) eller mangle en kapsel og være ikke-typebar (NTHi)1. Kolonisering af slimhinden med denne bakterie begynder i den tidlige barndom, og der er en omsætning af forskellige koloniserende stammer2. Denne bakterie er også i stand til invasion af både øvre og nedre luftveje; I denne sammenhæng kan det fremkalde aktivering af immunresponset og inflammation 3,4. Denne inflammatoriske respons kan forårsage klinisk sygdom og bidrage til en række vigtige respiratoriske tilstande, herunder bihulebetændelse, otitis media, bronkitis, cystisk fibrose, lungebetændelse og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). De fleste af disse forhold skyldes NTHi-stammer2. Denne artikel vil beskrive metoder til vurdering af respiratoriske immunresponser på Hi ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.
Metoderne beskrevet nedenfor er blevet tilpasset fra veletablerede teknikker, der er blevet modificeret til at vurdere den inflammatoriske reaktion på Hi. Udvælgelsen af en passende antigenform af Hi er en vigtig del af denne vurdering. Antigene præparater spænder fra cellevægskomponenter til levende bakterier. For at etablere og standardisere assays kan brugen af perifere blodprøver være meget nyttigt i starten.
Flowcytometri muliggør måling af en række parametre og funktionelle assays fra en prøve på celleniveau. Denne teknik har den fordel, at specifikke cellulære reaktioner (f.eks. produktion af reaktive iltarter (ROS) eller intracellulær cytokinproduktion) kan vurderes sammenlignet med andre mere generelle metoder såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller ELISspot.
Ekstracellulære fælder udtrykkes af neutrofiler (NET’er)5,6,7 og af andre celler såsom makrofager (MET’er)8. De anerkendes i stigende grad som en vigtig inflammatorisk reaktion, især ved infektion i lungen9. De kan vurderes ved konfokal fluorescensmikroskopi. Denne teknik muliggør endelig identifikation af NET’er/MET’er og adskiller deres ekspression fra andre former for celledød6.
Både flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede assays. Deres succes er afhængig af optimale belastningsprotokoller for biologiske prøver. Disse metoder tager lidt tid at lære og kræver passende tilsynsekspertise. De involverede instrumenter er også dyre både at købe og køre. Den optimale ramme for deres anvendelse omfatter større universiteter og tertiære henvisningshospitaler.
De metoder, der anvendes i denne protokol, kan overføres til undersøgelse af andre lignende organismer, der er involveret i luftvejssygdomme (f.eks. Moxarella catarrhalis og Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerer også med andre almindelige åndedrætsbakterier10.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder, der er anført her, bruger fluorescensbaseret flowcytometri og konfokal mikroskopiteknikker, der kan bruges sammen for at få detaljerede oplysninger om det inflammatoriske lungerespons på Hi.
Etablering af den passende antigene formulering af Hi, der skal anvendes, er kritisk, og det er tilrådeligt at have specifikke input fra en mikrobiolog i denne henseende. Live Hi inducerer et stærkere svar, mens dræbte Hi-præparater og Hi-komponenter er mere standardiserede og er lettere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke personalet i klinisk immunologi hos Monash Health for deres hjælp med dette arbejde.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
