Использование секвенирования следующего поколения для выявления мутаций, связанных с восстановлением CAS9-индуцированного разрыва двойной цепи вблизи промотора CD4
Summary
Здесь представлена эндонуклеаза sgRNA/CAS9 и протокол секвенирования следующего поколения, который может быть использован для идентификации мутаций, связанных с восстановлением двухцепочечного разрыва вблизи промотора CD4.
Abstract
Двухцепочечные разрывы (DSB) в ДНК являются наиболее цитотоксическим типом повреждения ДНК. Поскольку множество оскорблений может привести к этим поражениям (например, стресс репликации, ионизирующее излучение, невосстановленное УФ-повреждение), DSB возникают в большинстве клеток каждый день. В дополнение к гибели клеток, невосстановленные DSB снижают целостность генома, и возникающие мутации могут привести к опухолевому генезу. Эти риски и распространенность DSB мотивируют исследования механизмов, с помощью которых клетки восстанавливают эти поражения. Секвенирование следующего поколения может быть сопряжено с индукцией DSB ионизирующим излучением, чтобы обеспечить мощный инструмент для точного определения мутаций, связанных с дефектами восстановления DSB. Однако этот подход требует вычислительно сложного и дорогостоящего секвенирования всего генома для обнаружения восстановления случайно возникающих DSB, связанных с ионизирующим излучением. Редкие режущие эндонуклеазы, такие как I-Sce1, обеспечивают способность генерировать один DSB, но их сайты распознавания должны быть вставлены в интересующий геном. В результате место ремонта по своей сути является искусственным. Последние достижения позволяют направлять РНК (sgRNA) направлять эндонуклеазу Cas9 в любой интересующий его локус генома. Это может быть применено к исследованию восстановления DSB, что делает секвенирование следующего поколения более экономически эффективным, позволяя ему сосредоточиться на ДНК, фланкирующей CAS9-индуцированный DSB. Цель рукописи состоит в том, чтобы продемонстрировать осуществимость этого подхода путем представления протокола, который может определить мутации, возникающие в результате восстановления DSB перед геном CD4. Протокол может быть адаптирован для определения изменений мутагенного потенциала DSB, связанных с экзогенными факторами, такими как ингибиторы репарации, экспрессия вирусного белка, мутации и воздействие окружающей среды с относительно ограниченными требованиями к вычислениям. После того, как геном организма был секвенирован, этот метод теоретически может быть использован в любом геномном локусе и в любой модели клеточной культуры этого организма, которая может быть трансфектирована. Подобные адаптации подхода могут позволить сравнивать точность репарации между различными локусами в одном и том же генетическом фоне.
Introduction
Поддержание геномной стабильности имеет решающее значение для всех живых организмов. Точная репликация ДНК и надежный ответ на повреждение ДНК (DDR) необходимы для добросовестного распространения генетического материала 1,2. Повреждения ДНК происходят регулярно в большинстве клеток 2,3. Когда эти повреждения ощущаются, прогрессирование клеточного цикла останавливается, и активируются механизмы репарации ДНК. Двухцепочечные разрывы в ДНК или DSB являются наиболее токсичным и мутагенным типом повреждения ДНК 3,4.
В то время как несколько сигнальных путей DDR могут восстанавливать эти поражения, наиболее тщательно изученными путями восстановления DSB являются гомологичная рекомбинация (HR) и негомологичное соединение конца (NHEJ). HR – это в значительной степени безошибочный путь, который восстанавливает DSB, используя сестринскую хроматиду в качестве гомологичного шаблона. Это имеет тенденцию происходить в фазе S и фазе G2 клеточного цикла 5,6,7. NHEJ более подвержен ошибкам, но это может произойти на протяжении всего клеточного цикла 8,9. Для измерения эффективности конкретных ремонтных механизмов были разработаны различные репортерные анализы 10,11,12. Эти анализы, как правило, полагаются на проточную цитометрию для высокопроизводительного измерения активности пути восстановления DSB с использованием GFP или mCherry в качестве считывания11,13. Несмотря на высокую эффективность, они полагаются на канонический ремонт, происходящий на искусственно введенном DSB.
Существует множество других методов, используемых для изучения ремонта DSB. Многие из них полагаются на иммунофлуоресцентную (IF) микроскопию 1,14. Микроскопия ПЧ обнаруживает дискретные ядерные очаги, представляющие ремонтные комплексы, после того, как ДСП индуцируются воздействием генотоксических химических веществ или ионизирующего излучения15,16. Отслеживание образования и разрешения этих очагов дает представление о начале и завершении ремонта соответственно14,17. Однако эти методы индукции DSB (т.е. химических веществ или ионизирующего излучения) не вызывают DSB в определенных местах генома. Также функционально невозможно использовать их для последовательного индуцирования только небольшого количества (например, 2-4) DSB. В результате наиболее часто используемые методы индуцирования DSB вызывают множество поражений, случайным образом распределенных по всему геному18. Небольшое количество DSB может быть введено путем вставки сайта распознавания для редкорезающей эндонуклеазы и экспрессии соответствующей эндонуклеазы, такой как I-Sce119. К сожалению, необходимая интеграция целевого участка препятствует исследованию DSB в эндогенных геномных локусах.
В этой рукописи описывается метод обнаружения мутаций, связанных с восстановлением DSB, сгенерированного в определяемом пользователем локусе. Приведен репрезентативный пример подхода, применяемого для оценки способности вирусного белка увеличивать количество мутаций, связанных с DSB. В частности, в этой рукописи описывается использование одной направляющей РНК (sgRNA) для направления эндонуклеазы CAS9 для индуцирования DSB в открытой рамке чтения CD4 человека в кератиноцитах крайней плоти человека, экспрессирующих векторный контроль (HFK LXSN) и HFK, который экспрессирует белок E6 вируса папилломы человека типа 8 (HFK 8E6). Целенаправленное секвенирование следующего поколения (NGS) области, окружающей разрыв, позволяет строго определять мутации, связанные с восстановлением поражения. Эти данные демонстрируют, что вирусный белок вызывает примерно 20-кратное увеличение мутаций во время восстановления DSB. Он также обеспечивает объективную характеристику мутагенных последствий DSB в одном локусе без необходимости секвенирования всего генома. В принципе, протокол может быть легко адаптирован для сравнения относительного риска мутаций между локусами генома или клеточными линиями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Помимо глубины предоставляемой информации, у этого метода есть несколько преимуществ. Во-первых, репарация DSB, теоретически, может быть оценена в любом геномном локусе без изменения генома интересующей клетки. Во-вторых, доступ к анализу ремонта NGS увеличивается за счет снижения затрат …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, о которых сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения (P20GM130448) (NAW и RP); Национальный институт рака Национальных институтов здравоохранения (NCI R15 CA242057 01A1); Исследовательский центр рака Джонсона в Университете штата Канзас; и Министерство обороны США (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Мы ценим KSU-CVM Confocal Core и Джоэла Саннемана за нашу иммунофлуоресцентную микроскопию. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения этих финансирующих учреждений.
Materials
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -. X. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. 유전학. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
