JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Optisk pincett för att studera RNA-proteininteraktioner i översättningsreglering

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Detta protokoll presenterar ett komplett experimentellt arbetsflöde för att studera RNA-proteininteraktioner med optisk pincett. Flera möjliga experimentella inställningar beskrivs inklusive kombinationen av optisk pincett med konfokal mikroskopi.

Abstract

RNA antar olika strukturella veck, som är väsentliga för dess funktioner och därmed kan påverka olika processer i cellen. Dessutom kan strukturen och funktionen hos ett RNA moduleras av olika transverkande faktorer, såsom proteiner, metaboliter eller andra RNAs. Frameshifting RNA-molekyler, till exempel, är reglerande RNAs belägna i kodningsregioner, som direkt översätter ribosomer till en alternativ öppen läsram och därmed fungerar som genbrytare. De kan också anta olika veck efter bindning till proteiner eller andra transfaktorer. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det viktigt att studera samspelet och mekaniska egenskaper hos dessa RNA-proteinkomplex samtidigt. Detta arbete illustrerar hur man använder enmolekyl-fluorescenskopplade optiska pincett för att utforska det konformationella och termodynamiska landskapet av RNA-proteinkomplex med hög upplösning. Som ett exempel, interaktionen mellan SARS-CoV-2 programmerade ribosomal frameshifting element med den transverkande faktorn kort isoform av zink-finger antiviralt protein utarbetas. Dessutom övervakades fluorescensmärkta ribosomer med hjälp av den konfokala enheten, vilket i slutändan skulle möjliggöra studier av översättningsförlängning. Fluorescenskopplad OT-analys kan tillämpas i stor utsträckning för att utforska olika RNA-proteinkomplex eller transverkande faktorer som reglerar översättning och kan underlätta studier av RNA-baserad genreglering.

Introduction

Överföring av genetisk information från DNA till proteiner genom mRNAs är en komplex biokemisk process, som regleras exakt på alla nivåer genom makromolekylära interaktioner inuti celler. För translationell reglering ger RNA-proteininteraktioner en kritisk roll för att snabbt reagera på olika stimuli och signaler1,2. Vissa RNA-proteininteraktioner påverkar mRNA-stabiliteten och ändrar därmed tiden då ett RNA är translationellt aktivt. Andra RNA-proteininteraktioner är associerade med recodingmekanismer såsom stop-codon readthrough, bypassing eller programmerad ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nyligen har ett antal RNA-bindande proteiner (RBPs) visat sig interagera med stimulerande mRNA-element och översättningsmaskineriet för att diktera när och hur mycket omkodning som kommer att ske i cellen7,8,9,10,11. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det därför avgörande att studera interaktionsprinciperna och mekaniska egenskaperna hos dessa RNA-proteinkomplex i detalj.

Årtionden av arbete har lagt grunden för att studera översättningsprocessen i flera steg och flera komponenter, som bygger på invecklad kommunikation mellan översättningsmaskineriets RNA- och proteinkomponenter för att uppnå hastighet och noggrannhet12,13,14. Ett viktigt nästa steg för att förstå komplexa regulatoriska händelser är att bestämma krafter, tidsskalor och strukturella bestämningsfaktorer under översättning med hög precision12,15,16,17. Studien av RNA-konformationsdynamik och särskilt hur transverkande hjälpfaktorer verkar på RNA-strukturen under översättningen har belysts ytterligare av framväxten av enmolekylverktyg, inklusive optiska pincett eller nolllägesvågledare16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optisk pincett (OT) representerar en mycket exakt enmolekylsteknik, som har tillämpats för att studera många typer av RNA-beroende dynamiska processer inklusive transkription och översättning26,27,28,29,30,31,32. Användningen av optiska pincett har gjort det möjligt att undersöka molekylära interaktioner, nukleinsyrastrukturer och termodynamiska egenskaper, kinetik och energier av dessa processer i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincettanalys är baserad på entrapment av mikroskopiska objekt med en fokuserad laserstråle. I ett typiskt OT-experiment är molekylen av intresse bunden mellan två genomskinliga (vanligtvis polystyren) pärlor (figur 1A)27. Dessa pärlor fångas sedan av optiska fällor, som beter sig som fjädrar. Således kan kraften som appliceras på molekylen beräknas baserat på pärlans förskjutning från mitten av den fokuserade laserstrålen (trap center). Nyligen har optiska pincett kombinerats med konfokal mikroskopi (figur 1B), vilket möjliggör fluorescens- eller Fret-mätningar (Förster resonance energy transfer)40,41,42. Detta öppnar ett helt nytt fält av möjliga experiment som möjliggör samtidig mätning och därmed exakt korrelation av kraftspektroskopi och fluorescensdata.

Här demonstrerar vi experiment med optisk pincett i kombination med konfokal mikroskopi för att studera protein-RNA-interaktioner som reglerar translationell frameshifting. Mellan målet och kondensorn möjliggör en flödescell med fem kanaler kontinuerlig provtillämpning med laminärt flöde. Genom de mikrofluidiska kanalerna kan olika komponenter injiceras direkt, vilket minskar den praktiska tiden samt möjliggör mycket liten provförbrukning under hela experimentet.

För det första föreslås en grundläggande riktlinje för att hjälpa utformningen av OT-experiment och fördelar samt fallgropar för olika inställningar diskuteras. Därefter beskrivs förberedelsen av prover och experimentella arbetsflöden och ett protokoll för dataanalysen tillhandahålls. För att representera ett exempel beskriver vi resultaten från RNA stretching experiment för att studera SARS-CoV-2 frameshifting RNA element (Figur 2A) med den transverkande faktorn den korta isoformen zink-finger antiviralt protein (ZAP), som ändrar översättningen av virala RNA från en alternativ läsram43. Dessutom visas det att fluorescensmärkta ribosomer kan användas i denna OT-konfokala analys, vilket skulle vara användbart för att övervaka översättningsmaskineriets processivitet och hastighet. Metoden som presenteras här kan användas för att snabbt testa effekten av olika buffertar, ligands eller andra cellulära komponenter för att studera olika aspekter av översättning. Slutligen diskuteras vanliga experimentella fallgropar och hur man felsöker dem. Nedan beskrivs några viktiga punkter i experimentell design.

Konstruera design
I princip finns det två vanliga metoder för att skapa en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Det första tillvägagångssättet använder en lång RNA-molekyl som hybridiseras med kompletterande DNA-handtag, vilket ger en konstruktion bestående av två RNA/DNA-hybridregioner som flankerar en enkelsträngad RNA-sekvens i mitten (figur 2B). Detta tillvägagångssätt används i de flesta OT RNA-experiment33,44,45.

Den andra metoden drar nytta av dsDNA-handtag med korta (cirka 20 nt) överhäng15,17. Dessa överhäng hybridiseras sedan med RNA-molekylen. Även om det är mer komplicerat i design, övervinner användningen av dsDNA-handtag några av begränsningarna i DNA / RNA-hybridsystemet. I princip kan även mycket långa handtag (>10kb) genomföras, vilket är bekvämare för konfokala mätningar. Dessutom kan RNA-molekylen ligeras till DNA-handtag för att öka tjuderstabiliteten.

Strategi för slutmärkning
Konstruktionen måste bindas till pärlor via en stark molekylär interaktion. Även om det finns metoder för kovalent bindning av handtag till pärlor46, används starka men icke-kovalenta interaktioner såsom streptavidin-biotin och digoxigenin-antikropp ofta i OT-experiment15,33,35,45. I det beskrivna protokollet är konstruktionen märkt med biotin eller digoxigenin, och pärlorna är belagda med streptavidin eller antikroppar mot digoxigenin (figur 1A). Detta tillvägagångssätt skulle vara lämpligt för att tillämpa krafter upp till cirka 60 pN (per tjuder)47. Dessutom gör användningen av olika 5′ och 3′ märkningsstrategier det möjligt att bestämma orienteringen av tjudret som bildas mellan pärlorna17.

Proteinmärkning för fluorescensmätningar
För den konfokala avbildningen finns det flera vanliga metoder för fluorescensmärkning. Till exempel kan fluoroforer kovalent fästas vid aminosyrarester som finns infödda i proteiner eller introduceras av platsstyrd mutagenes genom en reaktiv organisk grupp. Tiool- eller aminreaktiva färgämnen kan användas för märkning av cystein- respektive lysinrester. Det finns flera reversibla skyddsmetoder för att öka specificiteten hos märkning48,49, men inhemska proteiner skulle vanligtvis märkas vid flera rester. Även om fluoroforens lilla storlek kan ge en fördel, kan icke-specifik märkning störa proteinaktiviteten och därmed kan signalintensiteten variera49. Beroende på märkningens effektivitet kan signalintensiteten också skilja sig mellan olika experiment. Därför bör en aktivitetskontroll utföras före experimentet.

Om proteinet av intresse innehåller en N- eller C-terminaltagg, till exempel en His-tag eller strep-tag, representerar specifik märkning av dessa taggar en annan populär metod. Dessutom minskar taggriktad märkning risken för att fluoroforen stör proteinaktiviteten och kan öka lösligheten49. Taggspecifik märkning ger dock vanligtvis monofluoformärkta proteiner, vilket kan vara utmanande att upptäcka. Ett annat sätt att specifik märkning kan uppnås genom att använda antikroppar.

Konfiguration av mikrofluidik
Kombinationen av OT med ett mikrofluidiksystem möjliggör en snabb övergång mellan olika experimentella tillstånd. Dessutom drar strömsystem nytta av att upprätthålla det laminära flödet inuti flödescellen, vilket utesluter blandning av vätskor från andra kanaler i vinkelrät riktning i förhållande till flödesriktningen. Därför är laminärt flöde särskilt fördelaktigt för den experimentella designen. För närvarande används ofta flödesceller med upp till 5 kanaler (figur 3).

Protocol

1. Provberedning Klona intressesekvensen i vektorn som innehåller Lambda DNA-fragment, som fungerar som handtagssekvenser (figur 2)43,50. Generera först en DNA-mall för efterföljande in vitro-transkription via PCR (figur 2B; reaktion 1). I detta PCR-steg läggs T7-promotorn till i 5′ slutet av avkännings-DNA-molekylen32,33,43,50.<…

Representative Results

I detta avsnitt ges fokus främst på mätningar av RNA-protein/ligand interaktioner av fluorescens optisk pincett. För en beskrivning av allmänna RNA optiska pincettexperiment och motsvarande representativa resultat, se32. För mer detaljerad diskussion av RNA/DNA-proteininteraktionerna, se också1,2,26,59,60. <p class="jove_cont…

Discussion

Här visar vi användningen av fluorescenskopplade optiska pincett för att studera interaktioner och dynamiskt beteende hos RNA-molekyler med olika ligands. Nedan diskuteras kritiska steg och begränsningar av den nuvarande tekniken.

Kritiska steg i protokollet
Liksom för många andra metoder är provets kvalitet avgörande för att få tillförlitliga data. För att få prover av högsta möjliga kvalitet är det därför värt att spendera tid för att optimera procedur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Anuja Kibe och jun. Prof. Redmond Smyth för att de kritiskt granskar manuskriptet. Vi tackar Tatyana Koch för teknisk experthjälp. Vi tackar Kristyna Pekarkova för hjälpen med att spela in experimentella videor. Arbetet i vårt laboratorium stöds av Helmholtz Association och finansiering från Europeiska forskningsrådets (ERC) anslag nr. 948636 (till NC).

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
기타
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O’Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O’Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Optical TweezersRNA-protein InteractionsTranslation RegulationSingle Molecule TechniquesFluorescence Assisted Optical TweezersForce-ramp ExperimentsConstant Force MeasurementsReal-time VisualizationDNA-RNA ConstructIn-vitro TranscriptionPCR Reactions
check_url/kr/62589?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image