Detta protokoll presenterar ett komplett experimentellt arbetsflöde för att studera RNA-proteininteraktioner med optisk pincett. Flera möjliga experimentella inställningar beskrivs inklusive kombinationen av optisk pincett med konfokal mikroskopi.
RNA antar olika strukturella veck, som är väsentliga för dess funktioner och därmed kan påverka olika processer i cellen. Dessutom kan strukturen och funktionen hos ett RNA moduleras av olika transverkande faktorer, såsom proteiner, metaboliter eller andra RNAs. Frameshifting RNA-molekyler, till exempel, är reglerande RNAs belägna i kodningsregioner, som direkt översätter ribosomer till en alternativ öppen läsram och därmed fungerar som genbrytare. De kan också anta olika veck efter bindning till proteiner eller andra transfaktorer. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det viktigt att studera samspelet och mekaniska egenskaper hos dessa RNA-proteinkomplex samtidigt. Detta arbete illustrerar hur man använder enmolekyl-fluorescenskopplade optiska pincett för att utforska det konformationella och termodynamiska landskapet av RNA-proteinkomplex med hög upplösning. Som ett exempel, interaktionen mellan SARS-CoV-2 programmerade ribosomal frameshifting element med den transverkande faktorn kort isoform av zink-finger antiviralt protein utarbetas. Dessutom övervakades fluorescensmärkta ribosomer med hjälp av den konfokala enheten, vilket i slutändan skulle möjliggöra studier av översättningsförlängning. Fluorescenskopplad OT-analys kan tillämpas i stor utsträckning för att utforska olika RNA-proteinkomplex eller transverkande faktorer som reglerar översättning och kan underlätta studier av RNA-baserad genreglering.
Överföring av genetisk information från DNA till proteiner genom mRNAs är en komplex biokemisk process, som regleras exakt på alla nivåer genom makromolekylära interaktioner inuti celler. För translationell reglering ger RNA-proteininteraktioner en kritisk roll för att snabbt reagera på olika stimuli och signaler1,2. Vissa RNA-proteininteraktioner påverkar mRNA-stabiliteten och ändrar därmed tiden då ett RNA är translationellt aktivt. Andra RNA-proteininteraktioner är associerade med recodingmekanismer såsom stop-codon readthrough, bypassing eller programmerad ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nyligen har ett antal RNA-bindande proteiner (RBPs) visat sig interagera med stimulerande mRNA-element och översättningsmaskineriet för att diktera när och hur mycket omkodning som kommer att ske i cellen7,8,9,10,11. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det därför avgörande att studera interaktionsprinciperna och mekaniska egenskaperna hos dessa RNA-proteinkomplex i detalj.
Årtionden av arbete har lagt grunden för att studera översättningsprocessen i flera steg och flera komponenter, som bygger på invecklad kommunikation mellan översättningsmaskineriets RNA- och proteinkomponenter för att uppnå hastighet och noggrannhet12,13,14. Ett viktigt nästa steg för att förstå komplexa regulatoriska händelser är att bestämma krafter, tidsskalor och strukturella bestämningsfaktorer under översättning med hög precision12,15,16,17. Studien av RNA-konformationsdynamik och särskilt hur transverkande hjälpfaktorer verkar på RNA-strukturen under översättningen har belysts ytterligare av framväxten av enmolekylverktyg, inklusive optiska pincett eller nolllägesvågledare16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optisk pincett (OT) representerar en mycket exakt enmolekylsteknik, som har tillämpats för att studera många typer av RNA-beroende dynamiska processer inklusive transkription och översättning26,27,28,29,30,31,32. Användningen av optiska pincett har gjort det möjligt att undersöka molekylära interaktioner, nukleinsyrastrukturer och termodynamiska egenskaper, kinetik och energier av dessa processer i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincettanalys är baserad på entrapment av mikroskopiska objekt med en fokuserad laserstråle. I ett typiskt OT-experiment är molekylen av intresse bunden mellan två genomskinliga (vanligtvis polystyren) pärlor (figur 1A)27. Dessa pärlor fångas sedan av optiska fällor, som beter sig som fjädrar. Således kan kraften som appliceras på molekylen beräknas baserat på pärlans förskjutning från mitten av den fokuserade laserstrålen (trap center). Nyligen har optiska pincett kombinerats med konfokal mikroskopi (figur 1B), vilket möjliggör fluorescens- eller Fret-mätningar (Förster resonance energy transfer)40,41,42. Detta öppnar ett helt nytt fält av möjliga experiment som möjliggör samtidig mätning och därmed exakt korrelation av kraftspektroskopi och fluorescensdata.
Här demonstrerar vi experiment med optisk pincett i kombination med konfokal mikroskopi för att studera protein-RNA-interaktioner som reglerar translationell frameshifting. Mellan målet och kondensorn möjliggör en flödescell med fem kanaler kontinuerlig provtillämpning med laminärt flöde. Genom de mikrofluidiska kanalerna kan olika komponenter injiceras direkt, vilket minskar den praktiska tiden samt möjliggör mycket liten provförbrukning under hela experimentet.
För det första föreslås en grundläggande riktlinje för att hjälpa utformningen av OT-experiment och fördelar samt fallgropar för olika inställningar diskuteras. Därefter beskrivs förberedelsen av prover och experimentella arbetsflöden och ett protokoll för dataanalysen tillhandahålls. För att representera ett exempel beskriver vi resultaten från RNA stretching experiment för att studera SARS-CoV-2 frameshifting RNA element (Figur 2A) med den transverkande faktorn den korta isoformen zink-finger antiviralt protein (ZAP), som ändrar översättningen av virala RNA från en alternativ läsram43. Dessutom visas det att fluorescensmärkta ribosomer kan användas i denna OT-konfokala analys, vilket skulle vara användbart för att övervaka översättningsmaskineriets processivitet och hastighet. Metoden som presenteras här kan användas för att snabbt testa effekten av olika buffertar, ligands eller andra cellulära komponenter för att studera olika aspekter av översättning. Slutligen diskuteras vanliga experimentella fallgropar och hur man felsöker dem. Nedan beskrivs några viktiga punkter i experimentell design.
Konstruera design
I princip finns det två vanliga metoder för att skapa en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Det första tillvägagångssättet använder en lång RNA-molekyl som hybridiseras med kompletterande DNA-handtag, vilket ger en konstruktion bestående av två RNA/DNA-hybridregioner som flankerar en enkelsträngad RNA-sekvens i mitten (figur 2B). Detta tillvägagångssätt används i de flesta OT RNA-experiment33,44,45.
Den andra metoden drar nytta av dsDNA-handtag med korta (cirka 20 nt) överhäng15,17. Dessa överhäng hybridiseras sedan med RNA-molekylen. Även om det är mer komplicerat i design, övervinner användningen av dsDNA-handtag några av begränsningarna i DNA / RNA-hybridsystemet. I princip kan även mycket långa handtag (>10kb) genomföras, vilket är bekvämare för konfokala mätningar. Dessutom kan RNA-molekylen ligeras till DNA-handtag för att öka tjuderstabiliteten.
Strategi för slutmärkning
Konstruktionen måste bindas till pärlor via en stark molekylär interaktion. Även om det finns metoder för kovalent bindning av handtag till pärlor46, används starka men icke-kovalenta interaktioner såsom streptavidin-biotin och digoxigenin-antikropp ofta i OT-experiment15,33,35,45. I det beskrivna protokollet är konstruktionen märkt med biotin eller digoxigenin, och pärlorna är belagda med streptavidin eller antikroppar mot digoxigenin (figur 1A). Detta tillvägagångssätt skulle vara lämpligt för att tillämpa krafter upp till cirka 60 pN (per tjuder)47. Dessutom gör användningen av olika 5′ och 3′ märkningsstrategier det möjligt att bestämma orienteringen av tjudret som bildas mellan pärlorna17.
Proteinmärkning för fluorescensmätningar
För den konfokala avbildningen finns det flera vanliga metoder för fluorescensmärkning. Till exempel kan fluoroforer kovalent fästas vid aminosyrarester som finns infödda i proteiner eller introduceras av platsstyrd mutagenes genom en reaktiv organisk grupp. Tiool- eller aminreaktiva färgämnen kan användas för märkning av cystein- respektive lysinrester. Det finns flera reversibla skyddsmetoder för att öka specificiteten hos märkning48,49, men inhemska proteiner skulle vanligtvis märkas vid flera rester. Även om fluoroforens lilla storlek kan ge en fördel, kan icke-specifik märkning störa proteinaktiviteten och därmed kan signalintensiteten variera49. Beroende på märkningens effektivitet kan signalintensiteten också skilja sig mellan olika experiment. Därför bör en aktivitetskontroll utföras före experimentet.
Om proteinet av intresse innehåller en N- eller C-terminaltagg, till exempel en His-tag eller strep-tag, representerar specifik märkning av dessa taggar en annan populär metod. Dessutom minskar taggriktad märkning risken för att fluoroforen stör proteinaktiviteten och kan öka lösligheten49. Taggspecifik märkning ger dock vanligtvis monofluoformärkta proteiner, vilket kan vara utmanande att upptäcka. Ett annat sätt att specifik märkning kan uppnås genom att använda antikroppar.
Konfiguration av mikrofluidik
Kombinationen av OT med ett mikrofluidiksystem möjliggör en snabb övergång mellan olika experimentella tillstånd. Dessutom drar strömsystem nytta av att upprätthålla det laminära flödet inuti flödescellen, vilket utesluter blandning av vätskor från andra kanaler i vinkelrät riktning i förhållande till flödesriktningen. Därför är laminärt flöde särskilt fördelaktigt för den experimentella designen. För närvarande används ofta flödesceller med upp till 5 kanaler (figur 3).
Här visar vi användningen av fluorescenskopplade optiska pincett för att studera interaktioner och dynamiskt beteende hos RNA-molekyler med olika ligands. Nedan diskuteras kritiska steg och begränsningar av den nuvarande tekniken.
Kritiska steg i protokollet
Liksom för många andra metoder är provets kvalitet avgörande för att få tillförlitliga data. För att få prover av högsta möjliga kvalitet är det därför värt att spendera tid för att optimera procedur…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Anuja Kibe och jun. Prof. Redmond Smyth för att de kritiskt granskar manuskriptet. Vi tackar Tatyana Koch för teknisk experthjälp. Vi tackar Kristyna Pekarkova för hjälpen med att spela in experimentella videor. Arbetet i vårt laboratorium stöds av Helmholtz Association och finansiering från Europeiska forskningsrådets (ERC) anslag nr. 948636 (till NC).
Bacterial Strains | |||
E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
Chemicals and enzymes | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
Kits | |||
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
Oligonucleotides | |||
5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
DNA vectors | |||
pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
Software and Algorithms | |||
Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
Bluelake | Lumicks | N/A | |
Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
기타 | |||
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
Devices | |||
C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |