Mikroinjektionsmetode for Anopheles gambiae embryoner
Summary
Mikroinjektionsteknikker er afgørende for at introducere udefrakommende gener i myggenes genomer. Denne protokol forklarer en metode, der anvendes af James laboratorium til microinject DNA konstruktioner i Anopheles gambiae embryoner til at generere forvandlede myg.
Abstract
Embryo mikroinjektion teknikker er afgørende for mange molekylære og genetiske undersøgelser af insektarter. De giver et middel til at indføre udefrakommende DNA-fragmenter, der kodning gener af interesse samt gunstige træk i insektkimlinjen på en stabil og arvelig måde. De resulterende transgene stammer kan studeres for fænotypiske ændringer som følge af ekspressionen af det integrerede DNA til at besvare grundlæggende spørgsmål eller anvendes i praktiske anvendelser. Selvom teknologien er ligetil, kræver det af investigator tålmodighed og praksis for at opnå et niveau af dygtighed, der maksimerer effektiviteten. Vist her er en metode til mikroinjektion af embryoner af den afrikanske malaria myg, Anopheles gambiae. Målet er at levere eksogent DNA ved mikroinjektion til embryoet, så det kan tages op i de udviklende kimlinjeceller (pol). Udtryk fra det injicerede DNA af transposaser, integrases, rekombininaser eller andre nukleaser (for eksempel CRISPR-associerede proteiner, Cas) kan udløse hændelser, der fører til dens kovalente indsættelse i kromosomer. Transgena gambiae genereret fra disse teknologier er blevet brugt til grundlæggende undersøgelser af immunsystemets komponenter, gener involveret i blod-fodring, og elementer i olfaktoriske system. Derudover er disse teknikker blevet brugt til at producere An. gambiae stammer med træk, der kan hjælpe med at kontrollere overførsel af malaria parasitter.
Introduction
Mikroinjektionsteknikker er blevet brugt til eksperimentelt at manipulere organismer siden begyndelsen af 1900-tallet1. Mikroinjektion er blevet brugt til at studere både grundlæggende biologiske funktioner og/eller indføre vigtige ændringer i biologien i en ønsket organisme. Mikroinjektionsteknikken har været af særlig interesse for vektorbiologer og har i vid udstrækning været brugt til at manipulere vektorgenomer2-11. Transgeneseforsøg i leddyrvektorer har ofte til formål at gøre vektorer mindre effektive til at overføre patogener ved enten at vedtage ændringer, der reducerer en vektors kondition eller øger ildfastheden til de patogener, de overfører. Myg overfører en række menneskelige patogener og har en betydelig indvirkning på sygelighed og dødelighed på verdensplan. Anopheles slægten af myg overfører de humane malaria parasitære patogener, Plasmodium spp. Genteknologiske eksperimenter med Anopheles har til formål bedre at forstå biologien og reducere disse mygs vektorkapacitet i bestræbelserne på at udvikle nye malaria elimineringsstrategier.
Myg vektorer, der bidrager med flest malaria infektioner på verdensplan er i Anopheles gambiae arter kompleks. Men, de fleste af vellykkede transgenese eksperimenter er blevet udført på malaria vektor af det indiske subkontinent, Anopheles stephensi. Mens masser af laboratorietilpassede Anopheles gambiae stammer eksisterer, antallet af transgene Anopheles gambiae spp linjer rapporteret i litteraturen ikke sammenligne med Anopheles stephensi. Det menes, at Anopheles gambiae embryo er vanskeligere at injicere og opnå en vellykket transgenese end Anopheles stephensi, selv om årsagerne til disse forskelle er ukendte. Denne protokol beskriver en metode, der har vist sig at være konsekvent vellykket i at opnå transgenese af Anopheles gambiae embryoner via mikroinjektion. Protokollen er baseret på en metode, der tidligere er udviklet af Hervé Bossin og Mark Benedict12 med nogle yderligere detaljer og ændringer tilføjet, der har vist sig at øge effektiviteten af transgenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den øgede tilgængelighed af præcise og fleksible genteknologiske teknologier som CRISPR/Cas9 kan transgene organismer udvikles på en mere ligetil og stabil måde end tidligere muligt. Disse værktøjer har gjort det muligt for forskere at skabe transgene stammer af myg vektorer, der er meget tæt på at opnå de ønskede egenskaber af enten ildfasthed til patogener (befolkningsmodifikation) eller arvelig sterilitet (befolkning undertrykkelse). For at udvikle de mest sikre og stabile genetisk modificerede myg, der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for myg opdræt. Finansieringen blev ydet af University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
