Mikroinjektionsmetod för anopheles gambiae embryon
Summary
Mikroinjektionstekniker är viktiga för att introducera exogena gener i myggens genom. Detta protokoll förklarar en metod som används av James-laboratoriet för att mikroinjektionera DNA-konstruktioner till Anopheles gambiae-embryon för att generera förvandlade myggor.
Abstract
Embryomikroinjektionstekniker är viktiga för många molekylära och genetiska studier av insektsarter. De ger ett sätt att införa exogena DNA-fragment som kodar gener av intresse samt gynnsamma egenskaper i insektsgroddlinjen på ett stabilt och ärftligt sätt. De resulterande transgena stammarna kan studeras för fenotypiska förändringar till följd av uttrycket av det integrerade DNA för att svara på grundläggande frågor eller användas i praktiska tillämpningar. Även om tekniken är enkel kräver det av utredaren tålamod och övning för att uppnå en färdighetsnivå som maximerar effektiviteten. Visas här är en metod för mikroinjektion av embryon av den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae. Målet är att med mikroinjektion leverera exogent DNA till embryot så att det kan tas upp i de framväxande könscellerna (polerna). Uttryck från injicerat DNA från transposaser, integraser, rekombinaser eller andra nukleaser (till exempel CRISPR-associerade proteiner, Cas) kan utlösa händelser som leder till dess kovalenta införande i kromosomer. Transgen an. gambiae som genereras från dessa tekniker har använts för grundläggande studier av immunsystemets komponenter, gener som är involverade i blodmatning och delar av luktsystemet. Dessutom har dessa tekniker använts för att producera An. gambiae stammar med egenskaper som kan hjälpa till att kontrollera överföringen av malaria parasiter.
Introduction
Mikroinjektionstekniker har använts för att experimentellt manipulera organismer sedan början av 1900-talet1. Mikroinjektion har använts för att studera både grundläggande biologiska funktioner och/eller införa viktiga förändringar i en önskad organisms biologi. Mikroinjektionstekniken har varit av särskilt intresse för vektorbiologer och har använts i stor utsträckning för att manipulera vektorgenom2-11. Transgenes experiment i arthropod vektorer syftar ofta till att göra vektorer mindre effektiva vid överföring av patogener genom att antingen anta förändringar som minskar en vektors kondition eller öka refraktoritet till de patogener de överför. Myggor överför en mängd olika mänskliga patogener och har en betydande inverkan på sjuklighet och dödlighet över hela världen. Anopheles-släktet av myggor överför de mänskliga malariaparasitära patogenerna, Plasmodium spp. Genteknikexperiment med Anopheles har syftat till att bättre förstå biologin och minska dessa myggors vektorkapacitet i försök att utveckla nya malariaelimineringsstrategier.
De myggvektorer som bidrar med flest malariainfektioner i världen finns i Anopheles gambiae artkomplex. Majoriteten av framgångsrika transgenesexperiment har dock utförts på malariavektorn hos den indiska subkontinenten, Anopheles stephensi. Medan det finns gott om laboratorieanpassade Anopheles gambiae-stammar, är antalet transgena Anopheles gambiae spp. linjer som rapporteras i litteraturen inte jämföras med Anopheles stephensi. Man tror att Anopheles gambiae embryo är svårare att injicera och uppnå framgångsrik transgenes än Anopheles stephensi, även om orsakerna till dessa skillnader är okända. Detta protokoll beskriver en metod som har visat sig vara konsekvent framgångsrik för att uppnå transgenes av Anopheles gambiae embryon via microinjection. Protokollet bygger på en metod som tidigare utvecklats av Hervé Bossin och Mark Benedict12 med några ytterligare detaljer och ändringar som har visat sig öka effektiviteten av transgenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med den ökade tillgången till exakt och flexibel genteknik som CRISPR/Cas9 kan transgena organismer utvecklas på ett enklare och stabilare sätt än tidigare möjligt. Dessa verktyg har gjort det möjligt för forskare att skapa transgena stammar av myggvektorer som är mycket nära att uppnå de önskade egenskaperna hos antingen eldfasthet mot patogener (populationsmodifiering) eller ärftlig sterilitet (populationsdämpning). Men för att utveckla de säkraste och stabilaste genetiskt modifierade myggorna som möjl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell och Madeline Nottoli för mygghållning. Finansieringen tillhandahölls av University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ är professor i Donald Bren vid University of California, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
