아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

요약

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

배아 미세 주입 기술은 곤충 종의 많은 분자 및 유전 연구에 필수적입니다. 그(것)들은 안정적이고 헤아린 방식으로 곤충 생식선으로 유리한 특성뿐만 아니라 관심있는 유전자를 인코딩하는 외인성 DNA 단편을 소개하는 수단을 제공합니다. 결과 형질전환균은 기본적인 질문에 대답하거나 실제 응용분야에서 사용되는 통합 된 DNA의 발현으로 인한 표현성 변화를 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하지만 효율성을 극대화하는 수준의 기술을 달성하기 위해서는 조사자의 인내와 연습이 필요합니다. 여기에 표시 아프리카 말라리아 모기의 배아의 미세 주입을위한 방법이다, Anopheles 감비아. 목표는 개발 된 생식선 (극) 세포에서 채택 될 수 있도록 배아에 미세 주입 외인성 DNA에 의해 전달하는 것입니다. 트랜스포지아제, 정수, 재조합, 또는 기타 뉴클레아제(예: CRISPR 관련 단백질, Cas)의 주입된 DNA로부터 발현은 염색체로의 공유 삽입으로 이어지는 이벤트를 유발할 수 있다. 이러한 기술에서 생성된 트랜스제닉 An. 감비아는 면역 계통 구성 요소, 혈액 공급에 관여하는 유전자 및 후각 시스템의 요소에 대한 기본 연구에 사용되었습니다. 또한, 이러한 기술은 말라리아 기생충의 전송을 통제하는 것을 도울 수 있는 특성을 가진 An. 감비아인 긴장을 생성하는 데 이용되었습니다.

서론

미세 주입 기술은 1900년대 초부터 유기체를 실험적으로조작하는 데 사용되어 왔다. 미세 주입은 기본적인 생물학적 기능을 연구하고 원하는 유기체의 생물학에 중요한 변화를 도입하는 데 사용되었습니다. 미세 주입 기술은 벡터 생물학자에게 특히 관심이 있었으며 벡터 게놈^2-11을조작하는 데 널리 사용되어 왔다. 절지동물 벡터의 트랜스게네스 실험은 종종 벡터의 체력을 감소시키거나 전달되는 병원체에 대한 내화성을 증가시키는 변화를 제정함으로써 병원균을 전송하는 데 벡터를 덜 효율적으로 만드는 것을 목표로 합니다. 모기는 다양한 인간 병원체를 전송하고 전 세계적으로 이환율과 사망률에 중요한 영향을 미칩니다. 모기의 아노페스 속은 인간 말라리아 기생 병원균, 플라스모듐 spp를 전송합니다. Anopheles를 가진 유전 공학 실험은 생물학을 더 잘 이해하고 새로운 말라리아 제거 전략을 개발하기 위한 노력에 있는 이 모기의 벡터 용량을 감소시키는 것을 목표로 했습니다.

전 세계적으로 가장 말라리아 감염을 기여하는 모기 벡터는 Anopheles 감비아 종 복합체에 있습....

프로토콜

1. 미세 주입을 위한 모기 준비

1. 케이지¹³ (~5000cm^3)을~100명의 수컷과 200-300명의 암컷 1-2일 성인 1-2일 성인 1-2일 동안 종자하고 2일 동안 짝짓기를 허용합니다.
2. 짝짓기 기간 이후에는 인공 수식 장치로 2mL의 혈액을 사용하여 모기에게 혈액 식사를 제공하거나 곤충 관행에 따라 마취 된 동물을 살 수^{있습니다(14)} 다음 날 모기에게 두 번째 혈액 식사를 제공하여 모든 짝짓기 암컷이 먹이를 줄 기회가 있고 부분적으로 먹이는 모기가 완전히 강화되도록합니다.
3. 두 번째 혈액 식사 후 2-4 일 배아 수집을 위해 모기를 활용하십시오.
   참고: 라발 영양은 성인의 견고성과 생식 적합성에 중요합니다. 건강한 곤충을 후면하는 방법에 대한 자세한 내용은 베네딕트 외 (2020)를 참조하십시오^14. 모기가 인공 피더에 공급되거나 마취 된 동물을 살 때 계란 누워에 중요한 차이가 관찰되지 않았습니다. 곤충에서 Anopheles 감비아에 일상적으로 사용되는 방법을 사용하십시오.

2. 배아 준비

결과

설명된 미세 주입 프로토콜의 적용의 대표적인 예는 카르발라-Lejarazú 외^5에서발견될 수 있다. 여기서 의도는 An. gambiae의실험실 균주 G3의 세균에 자율 적인 유전자 구동 시스템을 삽입하는 것이었습니다. 이 시스템은 이 종의 제3 염색체에 대한 추기경 정형골 궤적 궤적(Agcd)을 대상으로 설계되었으며, 이는 3-하이드록시키누레닌의 환전을 xanthommatin으로 촉매하는 헴 과록시다아제, 옴모크롬 생합성의 마지막 단계(도11)를대상으로 설계되었다. 동질 유전자 드라이브 함유 모기는 유충, 푸파 및 새로 나타난 성인이 적목 현상형을 가진 기능 상실 추기경 돌연변이체입니다. 드라이브 시스템을 포함하는 플라스미드, pCO37은 An의 규제 요소를 제어하에 연쇄상 구균 pyogenes Cas9 (SpCas9) 엔도누셀리스를 표현한다. 감.......

토론

CRISPR/Cas9와 같은 정밀하고 유연한 유전 공학 기술의 가용성이 증가함에 따라 형질 전환 생물은 이전보다 보다 간단하고 안정적인 방식으로 개발될 수 있습니다. 이 공구는 연구원이 병원체 (인구 수정) 또는 헤아릴 수 있는 불임 (인구 억제)에 내화성의 원하는 속성을 달성에 아주 가까운 모기 벡터의 형질전환균을 만들 수 있었습니다. 그러나 가장 안전하고 안정적인 유전자 변형 모기를 개발하기 위해서는 추가 형질 전환선을 생성하고 평가하여 현장 연구를 위해 최적의 라인을 선택해야합니다. 설명된 프로토콜은 인구 수정 및 억제 전략을 위해 추가 후보자를 개발할 수 있도록 Anopheles gambiae 형질형 형질전환생성의 효율성을 높일 수 있습니다.

설명된 미세 주입 절차는 모기 또는 그밖 절지동물 벡터의 micro주입을 일상적으로 수행하는 실험실에서 유효할 가능성이 있는 장비 및 재질을 이용합니다. 프로토콜 전체의 세부 사항에 주의를 유지하는 것이 중요합니다. .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x 미세주입 완충액	-	-	1 mM NaHPO4 완충액, pH 6.8, 50 mM KCl
블로팅 멤브레인(Zeta-Probe GT 게놈 테스트 블로팅 멤브레인)	Bio-Rad		2x1cm 조각으로 깔끔하고 직선적으로 절단
원뿔형 튜브 50ml(일회용 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌)	Fisher 브랜드		엔드 컷
탈이온수 또는 이중 증류수(ddH20)	Mili-Q		세척 병에
해부 현미경	라이카	Leica MZ12	배아 정렬용
집게			5 호 크기
유리 용기	Pyrex	No. 3140	125 x 65
유리 슬라이드	Fisher 브랜드	번호 12-549-3	75x26 mm
인큐베이터	Barnsted Lab-line	모델 번호 150	28 ° C
KCl			50mM
라텍스 치과용 필름	Crosstex International	No. 19302
마이크로인젝터	서터 기기		XenoWorks 디지털 마이크로인젝터
마이크로로더 피펫 팁	에펜도르프		20 & 마이크로; L 마이크로로더 epT.I.P.S.
Micromanipulator	Sutter Instrument		XenoWorks Micromanipulator
Micropipette	라이닌		20 & 마이크로; L
마이크로피펫 풀러	Sutter Instrument	Sutter P-2000 마이크로피펫 풀러
현미경	Leica	DM 1000 LED 또는 M165 FC	마이크로주입용
최소 섬유 여과지	Fisher 브랜드	번호 05-714-4	크로마토그래피 종이, 두꺼운
모기	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, 짝짓기 성인 암컷, 폐하 후 4-5일 후 혈액 공급
NaHPO4 buffer			1 mM, ph 6.8
나일론 메시
페인트 브러시	Blick	No. 05831-7040	세밀, 크기 4/0
페트리 디쉬			플라스틱, (60x15 mm, 90x15 mm)
아세트산			3M
석영 유리 모세관	셔터 기기	번호 QF100-70-10	필라멘트 포함, 1mm OD,  ID 0.7 10cm 길이
물 PCR 등급	로슈	No. 03315843001

나트륨