Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.
Die erfolgreiche biochemische und biophysikalische Charakterisierung von ABC-Transportern hängt stark von der Wahl des heterologen Expressionssystems ab. In den letzten zwei Jahrzehnten haben wir eine Plattform zur Expression von Hefemembranproteinen entwickelt, mit der viele wichtige Pilzmembranproteine untersucht wurden. Der Expressionswirt Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wird in sieben großen endogenen ABC-Transportern gelöscht und enthält den Transkriptionsfaktor Pdr1-3 mit einer Gain-of-Function-Mutation, die die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteingene ermöglicht, die stabil als Einzelkopien am genomischen PDR5-Locus integriert sind. Die Erstellung vielseitiger Plasmidvektoren und die Optimierung einstufiger Klonierungsstrategien ermöglicht das schnelle und genaue Klonen, die Mutagenese und die Expression heterologer ABC-Transporter. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Verwendung eines neuartigen proteasespaltenden mGFPHis-Doppel-Tags (d.h. des monomeren hefeverstärkten grün fluoreszierenden Proteins yEGFP3, das mit einem Sechs-Histidin-Affinitätsreinigungs-Tag verschmolzen ist), das entwickelt wurde, um eine mögliche Interferenz des Tags mit dem interessierenden Protein zu vermeiden und die Bindungseffizienz des His-Tags an Nickelaffinitätsharze zu erhöhen. Die Fusion von mGFPHis mit dem Membranprotein ORF (Open Reading Frame) ermöglicht eine einfache Quantifizierung des Proteins durch Inspektion von Polyacrylamidgelen und Nachweis von Abbauprodukten unter Beibehaltung des mGFPHis-Tags. Wir zeigen, wie diese Funktion das Waschmittel-Screening auf Membranprotein-Solubilisierung erleichtert. Ein Protokoll zur effizienten, schnellen und zuverlässigen Isolierung der kleinräumigen Plasmamembranpräparate des C-terminal markierten Candida albicans Multidrug-Efflux-Transporters Cdr1, überexprimiert in S. cerevisiae ADΔΔ, wird vorgestellt. Dieses kleine Plasmamembran-Isolationsprotokoll erzeugt innerhalb eines einzigen Arbeitstages hochwertige Plasmamembranen. Die Plasmamembranpräparate können verwendet werden, um die Enzymaktivitäten von Cdr1- und Cdr1-Mutantenvarianten zu bestimmen.
Die Extraktion integraler Membranproteine aus ihrer nativen Lipidumgebung kann ihre Struktur und Funktion dramatisch beeinflussen1,2,3,4. Die komplexe Lipidzusammensetzung biologischer Membranen5 sorgt dafür, dass kritisch wichtige Protein-Lipid-Interaktionen auftreten können6. Lipide erhalten die strukturelle Integrität von Membranproteinen und ermöglichen es ihnen so, in ihrem Membrankompartiment-Ziel(e) korrekt zu funktionieren7,8. Daher ist ein kritischer erster Schritt bei der Reinigung des Membranproteins die Extraktion des Proteins aus seiner nativen Umgebung, ohne seine Struktur und / oder Funktion zu beeinträchtigen.
Es gibt viele Hindernisse für die Charakterisierung der Struktur von Membranproteinen, von denen die meisten mit ihrer hydrophoben Natur zusammenhängen, und die Schwierigkeiten, richtig gefaltete und funktionelle Membranproteine in den Mengen zu exprimieren, die für die Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind9,10,11,12. Es gibt drei Arten von Membranproteinexpressionssystemen: homologe9, heterologe13,14,15und in vitro Expressionssysteme 16,17. Die oft niedrigen Expressionsniveaus oder die unerschwinglichen Kosten vieler Expressionssysteme lassen nur wenige Wirte als bevorzugte Option zur Herstellung von Membranproteinen. Dazu gehören der bakterielle Wirt Escherichia coli,die Hefen S. cerevisiae und Pichia pastorissowie höhere Eukaryoten wie Sf9-Insektenzellen oder Säugetierzelllinien18. Alle Membranproteinexpressionstechnologien haben Vor- und Nachteile; S. cerevisiae ist jedoch vielleicht der am besten untersuchte eukaryotische Modellorganismus, der für die Membranproteinproduktion geeignet ist. Es ist sehr vielseitig mit Anwendungen in der Gentechnik, Wirkstoffforschung, synthetischen Biologie und der Expression von eukaryotischen Membranproteinen14,19,20,21.
In dieser Studie wurde eine patentierte S. cerevisiae Membranproteinexpressionstechnologie21 verwendet, mit S. cerevisiae ADΔ14 und ADΔΔ22 als bevorzugte Wirte (Abbildung 1A), um die Haupt-C. albicans Multidrug-Effluxpumpe Cdr1 zu überexprimieren und zu untersuchen. Beide S. cerevisiae-Stämme sind Derivate von AD1-8u–23, bei denen entweder das ura3 (ADΔ) oder sowohl das ura3- als auch das his1-Gen (ADΔΔ) gelöscht wurden, um falsch positive Uracil- oder Histidin-Prototroph-Transformanten zu eliminieren, die durch die unerwünschte Integration an den genomischen Loci URA3 oder HIS1 entstehen. Die In Abbildung 1Adargestellte Löschung der 7 wichtigsten Multidrug-Effluxpumpen23macht ADΔΔ exquisit empfindlich gegenüber den meisten Xenobiotika. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 bewirkt die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteine wie Cdr1 (rote Achtecke in Abbildung 1A)nach Integration der heterolog-ORF-haltigen Transformationskassette (Abbildung 1A) am genomischen PDR5-Locus (blaues Rechteck in Abbildung 1A)über zwei homologe Rekombinationsereignisse. Die korrekte Plasmamembranlokalisierung von C-terminal mGFPHis markierten Proteinen kann durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 1A), und das His-Tag kann zur Nickelaffinitätsreinigung des markierten Proteins verwendet werden. Das Klonen einiger Pilz-ABC-Transporter (z.B. Candida krusei ABC1)in pABC3-abgeleitete Plasmide war jedoch nicht möglich, da sie aufgrund der Zelltoxizität nicht in Escherichia coli vermehrt werden konnten. Dies führte zur Entwicklung des einstufigen Klonens von Membranproteinen14,24, die entweder an ihrem N- oder C-Terminus mit verschiedenen Affinitäts-, Epitop- oder Reporter-Tags direkt in S. cerevisiae ADΔΔ markiert sind (Abbildung 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-Stämme, die verschiedene CDR1-Mutanten überexprimieren, können auf diese Weise auch effizient erzeugt werden, indem bis zu fünf einzelne PCR-Fragmente verwendet werden, die sich um 25 bp überlappen (Abbildung 1C). Mit diesem Protokoll können viele ORFs von Interesse zu niedrigen Kosten und mit hoher Effizienz innerhalb kürzester Zeit geklont, ausgedrückt und charakterisiert werden. Die Transformationseffizienz reduziert sich mit jedem zusätzlichen PCR-Fragment nur ~2-fach.
Falls gewünscht, können Ausdrucksebenen auch leicht durch Primer-Design manipuliert werden, um die Ausdruckspegel vorhersehbar auf 0,1% bis 50% der normalerweise hohen, konstitutiven Ausdrucksstufen25zu optimieren. Der optimierte, multifunktionale, pABC314 derivative Klonierungsvektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Abbildung 1B) enthält eine HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle (X; LEVLFQ| GP), eine Protease, die bei 4 °C besser abschneidet als die häufig verwendete Tabakätzvirus (TEV) Protease27. L ist ein Linker mit fünf Aminosäuren (GSGGS), mGFP ist eine monomere Mutante (A206K)28,29 Version der hefeverstärkten Grünfluoreszenzproteinvariante yEGFP330, und His ist ein Drei-Aminosäure-Linker (GGS), gefolgt von der Sechs-Histidin (HHHHHH) Nickelaffinität Proteinreinigungsmarkierung.
Diese Expressionstechnologie wurde erfolgreich in der Wirkstoffforschung und der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Die erste Struktur für ein Pilzazol-Wirkstoffziel, S. cerevisiae Erg1131, wurde mit dieser Technologie gelöst. Es ermöglichte auch die detaillierte Charakterisierung von C. albicans Cdr132,33,34 und die Schaffung eines Cystein-defizienten Cdr1-Moleküls35, das für Cystein-Vernetzungsstudien geeignet ist, um jede zukünftige hochauflösende Struktur zu verifizieren. Viele andere ABC-Transporter von wichtigen menschlichen Pilzerregern (z. B. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei und der Fusarium solani-Artenkomplex) wurden ebenfalls ausführlich mit dieser Expressionsplattform24,36,37,38,39untersucht. Dies hat die Erzeugung eines Panels von S. cerevisiae-Stämmen ermöglicht, die Überflusspumpen überexprimieren, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen verwendetwurden,um das neuartige fluoreszierende Effluxpumpensubstrat Nilrot40 und spezifische41 und Breitbandpumpeninhibitoren14,33,42, 43,44 zu entdecken. Die Verwendung dieses Systems ermöglichte auch die Entdeckung von Clorgylin als erstem seiner Art Breitband-Pilz-Multidrug-Effluxpumpen-Inhibitor42.
Die vollständige Solubilisierung von Membranproteinen und die Schaffung einer homogenen Membranprotein-Mizellen-Zubereitung ohne endogene Lipide erfordert hohe Waschmittelkonzentrationen45. Leider inaktiviert dadurch aber auch oft das Membranprotein5,8,45,46. Die Eigenschaften von Waschmittelmonomeren und ihre Aggregation in Lösung werden durch die physikalischen Eigenschaften des hydrophoben Schwanzes, die Länge und Verzweigung der Alkylkette, das Vorhandensein eines aromatischen Kerns oder einer Fluoralkylseitenkette oder die Anzahl der Polyoxyethyleneinheiten beeinflusst. Daher ist das Waschmittel-Screening ein wichtiger erster Schritt, um das am besten geeignete Reinigungsmittel für die Membranprotein-Solubilisierung und -reinigung zu bestimmen.
C. albicans ist ein wichtiger menschlicher Pilzerreger immungeschwächter Personen, der schwere, lebensbedrohliche invasive Infektionen verursachen kann47, und es kann resistent gegen Azol-Antimykotika werden48,49. Einer der Hauptmechanismen der Multidrug-Resistenz von C. albicans ist die Überexpression von Cdr150, einem Typ II ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC)51 der ABCG-Unterfamilie, der sich in der Plasmamembran befindet. ABCG-Pilztransporter in voller Größe (bestehend aus zwei Nukleotidbindungsdomänen [NBDs] und zwei Transmembrandomänen [TMDs]) sind häufiger als pleiotrope Arzneimittelresistenztransporter (PDR) bekannt und zeichnen sich durch ihre einzigartige invertierte Domänentopologie [NBD-TMD]2 aus. PDR-Transporter kommen nur in Pflanzen52,53 und Pilzen54 vor. Trotz ihrer Bedeutung gibt es keine Strukturen für PDR-Transporter, obwohl Strukturen für menschliche ABCG-Transporter mittlerer Größe kürzlich gelöst wurden, was dazu beigetragen hat, das erste vorläufige Modell für Cdr133zu erstellen. Unsere jüngsten experimentellen Beweise deuten jedoch darauf hin, dass dieses Modell fehlerhaft ist, möglicherweise weil Pilz-PDR-Transporter charakteristische asymmetrische NBDs haben, was möglicherweise zu einem einzigartigen Transportmechanismus führt. Eine hochauflösende Struktur von Cdr1 ist daher sowohl für das rationale Design neuartiger Effluxpumpeninhibitoren erforderlich, die helfen können, effluxvermittelte Arzneimittelresistenzen zu überwinden, als auch um Einblicke in den Wirkmechanismus dieser wichtigen ABC-Transporterfamilie zu geben.
Ziel dieser Studie war es, zuverlässige Protokolle für die Expression, Solubilisierung und Reinigung von Cdr1 im genetisch veränderten Expressionswirt S. cerevisiae zu entwickeln, mit dem ultimativen Ziel, eine hochauflösende Struktur für Cdr1 zu erhalten. Im Rahmen dieses Prozesses wurde ein proteasespalter mGFPHis-Doppel-Tag (Abbildung 1B) mit einem 16-Rückstands-Linker entwickelt, der den Tag vom C-Terminus von Cdr1 trennt, was die Bindung des angehängten 6x His-Affinitäts-Tags an das Nickelaffinitätsharz verbesserte und die Überwachung der Cdr1-Expressionsniveaus in lebenden Zellen und während des gesamten Reinigungsprozesses ermöglichte. Es wurde auch ein reproduzierbares Protokoll für kleine Hefeplasmamembranproteinpräparate mit etwa 10% C. albicans Cdr1 (wie von Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE geschätzt) entwickelt, das für die biochemische Charakterisierung von Cdr1 verwendet werden könnte.
Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Strukturanalyse von Membranproteinen ist derzeit keine 3D-Struktur für Cdr1 oder einen anderen PDR-Transporter verfügbar. Daher ist es wichtig, Kenntnisse über die Cdr1-Struktur und ihre biochemischen Eigenschaften zu gewinnen, da dies nicht nur Einblicke in das rationale Design neuartiger Medikamente zur Überwindung von effluxvermittelter Arzneimittelresistenz geben wird, sondern auch in den Funktionsmechanismus einer wichtigen Unterfamilie von ABC-Proteinen.
<p class="jo…The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken der Finanzierung durch den New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) und einem Blockzuschuss der Medizinischen Fakultät der Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Sie danken der University of Otago für die Bereitstellung eines Promotionsstipendiums für G. Madani. Die Autoren danken auch Professor Stefan Raunser und seinen Kollegen Dr. Amir Apelbaum und Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam für ihre Unterstützung und Betreuung während eines 6-monatigen Besuchs von G. Madani am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie (MPIMP), Dortmund, Deutschland. Die Autoren danken auch dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) für die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums (57381332) für den Besuch des MPIMP durch G. Madani.
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG310S | LMNG |
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside | Anatrace | NG322S | DMNG |
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
CHAPS | Anatrace | C316S | |
CHAPSO | Anatrace | C317S | |
CSM | Formedium | DCS0019 | |
CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
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Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
DMSO | Merck | 67-68-5 | |
Ethanol | Merck | 459836 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | A blend of exonuclease and phosphatase |
Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
Glycine | Merck | G8898 | |
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KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Use for reliable colony PCR |
lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
MES | Formedium | 145224-94-8 | |
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
n-Decyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D322S | DM |
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n-Nonyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
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n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
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n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
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n-Undecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
polyethylene glycol (PEG 3350) | Sigma-Aldrich | 25322-68-3 | |
polyoxyethylenesorbitan monooleate | Sigma-Aldrich | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P8394 | |
Protein Assay Kit | Bio-Rad | 5000122 | RC DC Protein Assay Kit II |
QC Colloidal Coomassie Stain | Bio-Rad | 1610803 | |
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
Sodium dodecyl sulphate | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
Sodium L-ascorbate BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
Yeast extract | Formedium | 008013-01-2 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
Equipment (type) | |||
Centrifuge (Eppendorf 5804) | Eppendorf | ||
Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) | Bio-Rad | ||
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) | BioTek Instruments | ||
PCR thermal cycler (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
Power supply (PowerPac) | Bio-Rad | ||
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
Shaking incubator (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |