이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.
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방법 논문
칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비
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이 논문에서
요약
초록
ABC 수송기의 성공적인 생화학적 및 생물리적 특성화는 이종발형 발현 시스템의 선택에 크게 좌우됩니다. 지난 2년 동안, 우리는 많은 중요한 곰팡이 막 단백질을 연구하는 데 사용되어 온 효모 막 단백질 발현 플랫폼을 개발했습니다. 발현 숙주 사카로미세스 cerevisiae ADΔΔ는 7개의 주요 내인성 ABC 수송기에서 삭제되고 게놈 PDR5 locus에서 단일 사본으로 안정적으로 통합된 이종막 단백질 유전자의 구성 과잉 발현을 가능하게 하는 게인기능 돌연변이를 가진 전사 인자 Pdr1-3을 함유하고 있다. 다재다능한 플라스미드 벡터를 생성하고 1단계 복제 전략의 최적화를 통해 이종성 ABC 수송기의 신속하고 정확한 복제, 돌연변이 발생 및 표현을 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 새로운 프로테아제-클레이블 mGFPHis 이중 태그(즉, 단황 효모강화 녹색 형광 단백질 yEGFP3가 6-히스티딘 친화도 정화 태그에 융합)의 개발 및 사용을 설명하며, 이는 관심있는 단백질로 태그의 간섭가능성을 피하고 그의 태그의 결합 효율을 높이기 위해 고안되었다. mGFP의 융합막 단백질 ORF(오픈 리딩 프레임)는 폴리아크릴아미드 젤의 검사와 mGFPHis 태그를 유지하던 분해 제품의 검출을 통해 단백질의 용정화를 가능하게 한다. 우리는 이 기능이 막 단백질 용해화를 위한 세제 스크리닝을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. C-말단 태그칸디다 알비칸스 다중 약물 efflux 수송기 Cdr1S. cerevisiae ADΔΔ에서 과발현의 소규모 플라즈마 멤브레인 제제의 효율적이고 빠르고 신뢰할 수 있는 절연을 위한 프로토콜이 제시된다. 이 소규모 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜은 단일 작업 일 내에 고품질 플라즈마 멤브레인을 생성합니다. 플라즈마 멤브레인 제제는 Cdr1 및 Cdr1 돌연변이 변이체의 효소 활동을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
그들의 네이티브 지질 환경에서 일체형 막 단백질의 추출은 극적으로 그들의 구조 및 기능1,2,3,4에영향을 미칠 수 있습니다. 생물학적 막5의 복잡한 지질 조성물은 매우 중요한 단백질 지질 상호 작용이6을발생할 수 있도록 보장한다. 지질은 멤브레인 단백질의 구조적 무결성을 유지하므로 멤브레인 구획 대상에서 올바르게 작동할 수 있게 합니다7,8. 따라서 막 단백질 정제의 중요한 첫 번째 단계는 구조 및/또는 기능에 영향을 주지 않고 자국 의 환경으로부터 단백질을 추출하는 것이다.
막 단백질의 구조를 특성화하는 데는 많은 장애물이 있으며, 대부분은 소수성 특성과 관련이 있으며 X선 결정촬영 또는 극저온 전자 현미경(cryo-EM)9,10,....
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프로토콜
1. 변환 유능한 ADΔ 및 ADΔΔ 세포의 신선하거나 냉동 된 주식의 준비
- 2x YPCD의 25mL 접종[즉, 2x YPD; 2% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 4% (w/v) 덱스트로스), 0.079% (w/v) CSM (완전한 보충 혼합물)]35 중간 하나 효모 식민지와 함께 하룻밤 (o/n) 30 시간 당 30 °C에서 30 °C에 16 시간 (o/n).
- 25mL o/n 배양시 2x YPCD 배지의 225mL을 접종하고 600nm(OD600)에서세포 광학 밀도를 검사합니다. OD600은 일반적으로 ~0.5-1.0입니다.
참고: 이 단계에서다음 변환 실험에 필요한 모든 재료를 쉽게 사용할 수 있는지 확인합니다. - 세포 밀도가 ~6-8의 OD600에 도달할 때까지 200 rpm에서 흔들림으로 30°C에서 배양을 성장시면 추가로 ~6-8h를 증가시다.
참고: 달리 명시되지 않는 한 다음 단계는 실온(RT)에서 수행됩니다. - 3 분 동안 3,000 x g에서 원심 분리에 의해 이러한 로그산편 상 세포를 수확하십시오.
- 세포를 다시 중단하고 멸균 이중 증류수(ddH<....
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결과
S. 세레비시아에 ADΔΔ(~4 x 104 변압제/μg)의 고주파는 pYES2(도2B)로달성되었다. 예상대로, 노 DNA(즉, ddH2O만) 제어는 최적화된 ADΔΔ 변환 프로토콜을 통해 ~50트랜스펜션(도2C)을준 선형 CDR1-mGFPHis변형 카세트(도1A)의변압제를 제공하지 않았고, 1μg을 주지 않았다. CDR1-mGFPHis 변압제는 또한 결함이있는 미토콘드리아와 가능한 몸집이 작은 돌연변이를 제거하기 위해 발효 할 수없는 탄소 공급원에서 성장하는 능력에 대한 테스트되었습니다. 세 개(노란색 원; 도 2D) 테스트된 25개의 우라실-프로토트로프 변압제 중 YPG 한천판에서 성장할 수 없었고.......
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토론
멤브레인 단백질의 구조 적 분석이 최근 진행에도 불구하고 Cdr1 또는 다른 PDR 수송기를 위한 3D 구조는 현재 사용할 수 없습니다. 따라서 Cdr1 구조와 생화학 적 특징에 대한 지식을 얻는 것이 중요합니다.
멤브레인 단백질의 구조적 특성화를 위한 주요 요구 사항 중 하나는 X선 결정학 또는 극저온-EM에 필요한 수량으로 올바르게 접힌 및 그대로 막 단백질의 발현입니다. 발현 시스템을 선택할 때 중요한 기준은 사용의 용이성, 성장 속도 및 비용, 또한 단백질61,62의기능 및/또는 안정성에 중요할 수 있는 번역 후 변형으로 단백질을 표현하는 기능이다.
지난 2년 동안 S. cerevisiae 막 단백질 발현 기술60은 다양한 친화성, 에피토프 또는 리포터 태그와 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 뉴질랜드 마스덴 기금 (그랜트 UOO1305)의 자금 조달을 감사하게 인정하고, 의학 학부에서 블록 보조금을 인정, 출라롱콘 대학, 방콕, 태국 (M. Niimi). 그들은 박사 학위 장학금G. Madani를 제공 오타고 대학에 감사드립니다. 저자는 또한 스테판 라운서 교수와 그의 동료, 아미르 아펠바움 박사, 그리고 데이바야야바라시 비나야감 박사에게 감사를 표하고 싶다. 저자는 또한 G. Madani에게 MPIMP를 방문하는 연구 보조금 (57381332)을 제공 한 독일 학술 교환 서비스 (DAAD)에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2-(N-모르폴리노)에탄-설폰산(MES) | 시그마-알드리치 | M3671 | |
| 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(트리스 베이스, 초순수) | 머크 | 77-86-1 | |
| 2,2-디데실프로판-1,3-비스-&베타;-D-말토피라노시드 | 아나트레이스 | NG310S | LMNG |
| 2,2-디헥실프로판-1,3-비스-&베타;-D-글루코피라노시드 | 아나트레이스 | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2- 디 옥틸 프로판 -1,3- 비스-&베타; -D- 말토 피라 노시드 | 아나트레이스 | NG322S | DMNG |
| 4- 트랜스 - (4- 트랜스 프로필 시클로 헥실) - 시클로 헥실 &알파; -D- 말토 피라 노사이드 | 글리콘 Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-&알파; -M |
| 40 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (37.5 : 1) | 바이오 라드 | 1610148 | |
| 아세트산 (빙차) | 머크 | 64-19-7 | |
| 한천 | Formedium | 009002-18-0 | |
| 몰리브덴산 암모늄 | 그마-알드리치 | 13106-76-8 | |
| 과황산 암모늄 (APS) | 바이오 라드 | 1610700 | |
| ATP 디 소듐 염 | 시그마 -알드리치 | A-6419 | |
| 브로 모 페놀 블루 | SERVA 전기 영동 GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | 아나 트레이스 | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM 마이너스 우라실 | Formedium | DCS0161 | |
| Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | C327S | CYMAL-7 Cyclohexyl-methyl |
| -β- D-말토피라노시드 | 아나트레이스 | C321S | CYMAL-1 |
| 디지토닌 | 시그마-알드리치 | 11024-24-1 | |
| 디티오트레이톨(DTT) | 로슈 진단 | 10197785103 | |
| DMSO | 머크 | 67-68-5 | |
| 에탄올 | 머크 | 459836 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염(EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR 제품 정화 시약 | 적용 Biosystems | 78205 | 엑소뉴클레아제와 인산가수분해효소 |
| 포도 | Formedium | 50-99-7 | |
| 글리세롤 | Merck | 56-81-5 | |
| 글리신 | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| 염산 | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | 신뢰할 수 있는 식민지 PCR |
| 리튬 아세테이트(LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| 염화마그네슘 육사 수화물 | 시그마-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | , Anatrace | H110S, | HEGA-10 |
| N-Decanoyl-N-methyl-glucamide | , Anatrace | M320S, | MEGA-10 |
| n-Decyl-phosphocholine | , Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-Decyl-β-D-maltopyranoside | , Anatrace | D322S, | DM |
| n-Dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-Dodecyl-N, N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecyl-α -D-maltopyranoside | Anatrace | D310HA | α -DDM |
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| n-Nonyl-β -D-maltopyranoside | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-옥틸-&베타;-D-글루코피라노시드 | 아나트레이스 | O311S | |
| OG n-테트라데실-포스포콜린 | 아나트레이스 | F312S | 포스콜린-14 |
| n-테트라데실-베타;-D-말토피라노시드 | 아나트레이스 | T315S | TDM |
| n-트리데실-포스포콜린 | 아나트레이스 | F310S | 포스-콜린-13 |
| n-트리데실-&베타;- D-말토피라노시드 | 아나트레이스 | T323S-n | |
| -운데실-&베타;-D-말토피라노시드 | 아나트레이스 | U300S | UM (UDM |
| )N,N,N',N'-테트라메틸-에틸렌디아민(TEMED) | 시그마-알드리치 | T9281 | |
| 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 | 시그마-알드리치 | 9002-93-1 | 트리톤 X-100 |
| 올리고마이신 | 시그마-알드리치 | 75351 | |
| 펩톤 | Formedium | 3049-73-7 | |
| 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion 핫 스타트 플렉스 DNA 중합효소 | New England Biolabs | M0535S | 고충실도 DNA 중합효소 |
| 폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350) | 시그마-알드리치 | 25322-68-3 | |
| 폴리옥시에틸렌소비탄 모노올레에이 | 트 시그마-알드리치 | 9005-65-6 | TWEEN 80 |
| 질산칼 | 시그마-알드리치 | P8394 | |
| 단백질 분석 키트 | Bio-Rad | 5000122 | RC DC 단백질 분석 키트 II |
| QC 콜로이드 Coomassie 염색 | Bio-Rad | 1610803 | |
| Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) | Abcam | AB116028 | |
| 아지드 나트륨 | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| 도데실 황산 나트륨 | Sigma-Aldrich | 151-21-3 | SDS |
| L-아스코르브산 나트륨 BioXtra | Sigma-Aldrich | 11140 | |
| 설탕 Monododecanoate | Anatrace | S350S | DDS |
| 황산 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| 효모 추출물 | Formedium | 008013-01-2 | |
| 아미노산 없는 효모 질소 기반 | Formedium | CYN0402 | |
| 장비(유형) | |||
| 원심분리기 (에펜도르프 5804) | Eppendorf | ||
| Centrifuge (Beckman Ultra) | Beckman | ||
| Centrifuge (Sorvall RC6) | Sorvall | ||
| FSEC 장치 (형광 검출기, 자동시료주입기, 분획기가 장착된 NGC 크로마토그래피 중압 시스템) | Bio-Rad | ||
| Gel 이미징 (GelDoc EZ Imager) | Bio-Rad | ||
| 마이크로플레이트 리더 (Synergy 2 다중 검출) | BioTek Instruments | ||
| PCR 열 순환기 (C1000 Touch) | Bio-Rad | ||
| 전원 공급 장치 (PowerPac) | Bio-Rad | ||
| SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) | Bio-Rad | ||
| 진탕 인큐베이터 (Multitron) | Infors HT, Bottmingen | ||
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | GE17-5172-01 | |
| UV/가시광선 분광 광도계(Ultraspec 6300 pro) | Amersham BioSciences UK Ltd |
참고문헌
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or compl....
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