Optisk sektion och visualisering av den intervertebrala skivan från embryonal utveckling till degenerering
Summary
Vi presenterar en metod för att undersöka rumsliga chondrocyte organisation i anulus fibrosus av intervertebral skivan med hjälp av en optisk avsnittsmetod.
Abstract
Intervertebral skiva (IVD) degeneration är en ledande orsak till låg ryggsmärta och det medför en hög grad av nedskrivning för de drabbade individerna. För att avkoda skivdegeneration och för att kunna utveckla regenerativa metoder är en grundlig förståelse av IVD: s cellulära biologi avgörande. En aspekt av denna biologi som fortfarande förblir obesvarad är frågan om hur celler rumsligt är ordnade i ett fysiologiskt tillstånd och under degeneration. De biologiska egenskaperna hos IVD och dess tillgänglighet gör denna vävnad svår att analysera. Denna studie undersöker rumsliga chondrocyte organisation i anulus fibrosus från tidiga embryonala utveckling till slut-steg degeneration. En optisk sektionsmetod (Apotome) tillämpas för att utföra högupplösta färgningsanalyser med hjälp av embryonal vävnad av nötkreatur som djurmodell och vävnad från människa som erhållits från patienter som genomgår ryggkirurgi. Från en mycket hög chondrocyttäthet i den tidiga embryonala nötkreaturskivan minskar antalet celler under dräktigheten, tillväxten och mognaden. I mänskliga skivor åtföljde en ökning av cellulär densitet progressionen av vävnad degeneration. Som redan har visats i ledbrosk representerar klusterbildning en karakteristisk egenskap hos avancerad skiva degeneration.
Introduction
Den intervertebral skivan (IVD) är en broskbaserad struktur som biokemiskt och med avseende på cellulär arkitektur vid första anblicken liknar på många sätt ledbrosk1. Faktum är att både IVD-degeneration och artros (OA) av ledbrosk kännetecknas av att ledutrymmet förskred på grund av broskslitage, subkonndralcyst och osteofytbildning och subkonndral skleros2,3. Trots dessa till synes likheter arkitektur och funktionella roll av båda vävnader skiljer sig. Medan matrisen av ledbrosk huvudsakligen består av ett arkadbildande kollagen typ II-nätverk, består IVD av tre olika typer av vävnad: kollagen typ II-rik kärnmassa i mitten tar upp axiella belastningar och överför dem till en omfattande ring av tätt packade cirkulära kollagen typ I-fibrer som kallas anulus fibrosus. Deras funktion är att absorbera de översatta axiella tryck som tas emot av proteoglykan- och vattenrika kärnan med sin draghållna longitudinella fiberstyrka. Högst upp och längst upp i varje kärna och anulus bildar en hyalinebrosksk ändplatta korsningen till de intilliggande kotorna4 (figur 1).
I ledbrosk finns fyra distinkta rumsliga korndrocytmönster: par, strängar, dubbla strängar, små respektive stora kluster5,6,7 ( figur2). Förändringar i detta mönster är associerade med OA-debut och progression8,9. Rumslig chondrocytorganisation är också vägledande för en direkt funktionell egenskap hos brosk, nämligen dess styvhet, vilket understryker den funktionella relevansen av denna bildbaserade graderingsmetod10,11. Dessa mönster kan dessutom identifieras med redan befintlig kliniskt tillgänglig teknik12. På grund av likheterna mellan IVD och artikulärt brosk, kan det antas att karakteristiska chondrocyte mönster finns också i IVD. Klusterbildning är ett fenomen som också observeras i den degenererade IVD13,14.
När man försöker analysera rumslig cellulär organisation i IVD är det nödvändigt att övervinna flera tekniska svårigheter som inte finns när man undersöker ledbrosk:
För det första är bearbetningen av själva vävnaden mycket mer utmanande än med det homogena hyalinbrosket som till stor del består av kollagen typ II. IVD:s huvudsakliga fiberkomponent är kollagentyp I, vilket gör det mycket svårare att generera tunna histologiska sektioner. Medan i hyaline ledbrosk även tjocka sektioner lätt kan analyseras på grund av vävnadens “glasliknande” natur, är IVD: s kollagen typ I-nätverk optiskt mycket ogenomträngligt. Av denna anledning är ett starkt bakgrundsljud ett vanligt problem i IVD: s histologi. Ett snabbt och billigt sätt att penetrera denna optiskt täta vävnad är användningen av en optisk sektionsanordning, t.ex. med hjälp av en apotom. I en sådan apotom sätts ett galler in i belysningsvägen för ett konventionellt fluorescensmikroskop. Framför gallret placeras en planparallell glasplatta. Detta lutar fram och tillbaka och projicerar därmed rutnätet i bilden i tre olika lägen. För varje z-position skapas tre råa bilder med det projicerade rutnätet och läggs ovanpå. Med hjälp av speciell programvara kan det out of focus ljuset beräknas ut. Den underliggande principen är att om rutnätet är synligt är den informationen i fokus, om inte anses den vara ur fokus. Med denna teknik kan välfokuserade och högupplösta bilder förvärvas inom rimlig tid.
För det andra är vävnaden svår att få tag på från mänskliga donatorer. Vid total knäledsplastik kan hela ledens yta erhållas för ytterligare analys under operationen. Även om artros i en diarthrodial led också är en sjukdom i hela leden, finns det ändå starka fokala skillnader i broskets kvalitet med vanligtvis vissa områden i leden fortfarande intakta, till exempel på grund av minskad belastning i det området. Denna situation är annorlunda i IVD, där kirurgi vanligtvis endast utförs när skivan är globalt förstörd. När vävnaden erhålls från mänskliga donatorer från operationsrummet är den också mycket fragmenterad och det är nödvändigt att korrekt fördela vävnaden till en av de tre brosktyperna i IVD innan du gör ytterligare analyser. För att möjliggöra mer detaljerade analyser av även större vävnadssektioner och för att undersöka den embryonala utvecklingen av IVD är valet av en djurmodellorganism därför nödvändigt.
När man väljer en sådan modellorganism är det viktigt att ha ett system som är jämförbart med den mänskliga skivan med avseende på dess anatomi och dimensioner, dess mekaniska belastning, den nuvarande cellpopulationen samt dess vävnadssammansättning. För den presenterade tekniken här föreslår vi användning av bovin ländkotor skiva vävnad: En kritisk egenskap hos den mänskliga skivan som resulterar i dess låga regenerativa potential är förlusten av notokordal celler under mognad i kärnan. Men i många modellorganismer kan inteochordala celler detekteras hela sitt liv länge. De flesta av de få djur som förlorar sina notokordala celler som får, getter eller chondrodystrophig hundar har en IVD som är mycket mindre än mänskliga skivor. Endast ländryggsskivor av nötkreatur med en jämförbar sagittal skivdiameter med den hos ivds för människa15.
En nyckelfaktor som leder till tidig skivdegenerering är överdriven mekanisk belastning. De intradiskala trycken hos en stående ko i ländryggen är cirka 0,8 MPa med ryggraden justerad horisontellt. Förvånansvärt är dessa tryck jämförbara med de ländryggs intradiskala tryck som rapporterats för den erigerade mänskliga ryggraden (0,5 MPa)15,16. Även mängden vatten och proteoglykaner i nötkreaturskivor är jämförbar med IVD från unga människor17. Därför, även om rörelsesegmentens faktiska rörelsemönster kan skilja sig åt i fyrdubbla djur från den tvåbenta människan, med avseende på total lastning och skivegenskaper, är koen mycket närmare mänsklig biologi än andra etablerade djurmodeller för IVD som får och hundar.
I detta protokoll presenterar vi en teknik hur man analyserar förändringar i IVD ur synvinkeln av rumsliga chondrocyte organisation från tidiga embryonala utveckling till slutstadiet degeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av fluorescence mikroskopi förstärkt av mosaik imaging och optiska avsnitt, utvärderade vi det rumsliga arrangemanget av chondrocytes i anulus av ländkotor IVD under hela utveckling, mognad och degeneration. Medan degenerativ vävnad kunde skördas från patienter som fick ryggradskirurgi för skivdegeneration, krävde analys av embryonal period och mognadsfasen användning av en modellorganism (nötkreatur). Höga cellulära densiteter noterades i anulus under tidiga embryonala utveckling. Under den forts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar våra medförfattare från de ursprungliga publikationerna för deras hjälp och stöd. Vi tackar Charlotte Emma Bamberger för att hon hjälpte till att förvärva apotombilderna.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
