Optisk seksjonering og visualisering av mellomvirvelskiven fra embryonal utvikling til degenerasjon
Summary
Vi presenterer en metode for å undersøke romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus av mellomvirvelskiven ved hjelp av en optisk seksjoneringsmetode.
Abstract
Intervertebral plate (IVD) degenerasjon er en ledende årsak til ryggsmerter, og det medfører en høy grad av svekkelse for de berørte individene. Å dekode plate degenerasjon og å kunne utvikle regenerative tilnærminger en grundig forståelse av cellulær biologi av IVD er viktig. Et aspekt av denne biologien som fortsatt er ubesvart, er spørsmålet om hvordan celler er romlig ordnet i en fysiologisk tilstand og under degenerasjon. De biologiske egenskapene til IVD og dens tilgjengelighet gjør dette vevet vanskelig å analysere. Den nåværende studien undersøker romlig kondrocyttorganisasjon i anulus fibrosus fra tidlig embryonal utvikling til degenerasjon i sluttfasen. En optisk seksjoneringsmetode (Apotome) brukes til å utføre høyoppløselige fargingsanalyser ved hjelp av storfe embryonalt vev som dyremodell og humant skivevev hentet fra pasienter som gjennomgår ryggradskirurgi. Fra en svært høy kondrocytttetthet i den tidlige embryonale storfeskiven, reduseres antall celler under svangerskap, vekst og modning. I menneskelige plater fulgte en økning i cellulær tetthet utviklingen av vevsdegenerering. Som det allerede var demonstrert i leddbrusk, representerer klyngedannelse et karakteristisk trekk ved avansert platedegenerering.
Introduction
Mellomvirvelskiven (IVD) er en bruskbasert struktur som biokjemisk og med hensyn til cellulær arkitektur ved første øyekast ligner på mange måter leddbrusk1. Faktisk er både IVD-degenerasjon og slitasjegikt (OA) av leddbrusk preget av felles plass innsnevring på grunn av brusk slitasje, subkondral cyste og osteofyttdannelse, og subkondral sklerose2,3. Til tross for disse tilsynelatende likhetene er arkitektur og funksjonell rolle i begge vevene forskjellige. Mens matrisen av leddbrusk hovedsakelig er dannet av et arkadedannende kollagen type II-nettverk, består IVD av tre forskjellige typer vev: kollagentypen II-rik kjerne pulposus i midten tar opp aksiale belastninger og overfører dem til en omfattende ring av tettpakkede sirkulære kollagen type I-fibre som kalles anulus fibrosus. Deres funksjon er å absorbere de oversatte aksiale trykkene mottatt av den proteoglykan- og vannrike kjernen med deres strekkfaste langsgående fiberstyrke. Øverst og nederst i hver kjerne og anulus danner en hyalin brusk endeplate krysset til de tilstøtende ryggvirvlene4 (figur 1).
I leddbrusk finnes fire distinkte romlige kondrocyttmønstre: par, strenger, doble strenger, små, henholdsvis store klynger5,6,7 ( Figur2). Endringer i dette mønsteret er knyttet til OA-utbruddet og progresjonen8,9. Romlig kondrocyttorganisasjon er også veiledende for en direkte funksjonell egenskap av brusk, nemlig stivheten, som understreker den funksjonelle relevansen av denne bildebaserte graderingsmetoden10,11. Disse mønstrene kan i tillegg identifiseres med allerede eksisterende klinisk tilgjengelig teknologi12. På grunn av likhetene mellom IVD og leddbrusk, kan det hypoteses at karakteristiske kondrocyttmønstre også er til stede i IVD. Klyngedannelse er et fenomen som også observeres i degenerert IVD13,14.
Når du prøver å analysere romlig cellulær organisasjon i IVD, er det nødvendig å overvinne flere tekniske vanskeligheter som ikke er til stede når du undersøker leddbrusk:
For det første er behandling av vevet selv mye mer utfordrende enn med den homogene hyaline brusk som i stor grad består av kollagen type II. IVDs hovedfiberkomponent er kollagen type I, noe som gjør det mye vanskeligere å generere tynne histologiske seksjoner. Mens i hyalinartikulær brusk selv tykke seksjoner lett kan analyseres på grunn av vevets “glasslignende” natur, er kollagen type I-nettverket til IVD optisk svært ugjennomtrengelig. Av denne grunn er en sterk bakgrunnsstøy et vanlig problem i histologien til IVD. En rask og billig måte å trenge inn i dette optisk tette vevet er bruken av en optisk seksjoneringsenhet, for eksempel ved hjelp av en Apotome. I et slikt Apotome settes et rutenett inn i belysningsveien til et konvensjonelt fluorescensmikroskop. Foran rutenettet plasseres en plan-parallell glassplate. Dette vipper frem og tilbake og projiserer dermed rutenettet i bildet i tre forskjellige posisjoner. For hver z-posisjon opprettes tre RAW-bilder med det projiserte rutenettet og legges over. Ved hjelp av spesiell programvare kan lyset utenfor fokus beregnes ut. Det underliggende prinsippet er at hvis rutenettet er synlig, er denne informasjonen i fokus, hvis ikke anses den å være ute av fokus. Med denne teknikken kan godt fokuserte og høyoppløselige bilder skaffes på rimelig tid.
For det andre er vevet vanskelig å komme forbi fra menneskelige givere. Ved total kneutskifting kan hele overflaten av leddet oppnås for videre analyse under operasjonen. Selv om slitasjegikt i et diartropialt ledd også er en sykdom i hele leddet, er det likevel sterke fokusforskjeller i kvaliteten på brusk med vanligvis noen områder av leddet som fortsatt er intakte, for eksempel på grunn av redusert belastning i det området. Denne situasjonen er forskjellig i IVD, hvor kirurgi vanligvis bare utføres når platen er globalt ødelagt. Ved henting av vev fra menneskelige donorer fra operasjonsrommet er vevet også svært fragmentert, og det er nødvendig å tildele vevet riktig til en av de tre brusktypene til IVD før du gjør ytterligere analyser. For å tillate mer detaljerte analyser av også større vevsseksjoner og se på den embryonale utviklingen av IVD, er valget av en dyremodellorganisme derfor nødvendig.
Når du velger en slik modellorganisme, er det viktig å ha et system som er sammenlignbart med den menneskelige platen med hensyn til anatomi og dimensjoner, dens mekaniske belastning, dagens cellepopulasjon samt vevssammensetningen. For den presenterte teknikken her foreslår vi bruk av bovint lumbalskivevev: En kritisk egenskap ved den menneskelige platen som resulterer i sitt lave regenerative potensial er tap av notochordale celler under modning i kjernen. Men i mange modellorganismer kan notochordale celler oppdages hele livet. De fleste av de få dyrene som mister sine notokordale celler som sauer, geiter eller kondrodystrophig hunder har en IVD som er mye mindre enn menneskelige plater. Bare lumbale bovinskiver er tilstede med en sammenlignbar sagittal platediameter med de av menneskelige IVDer15.
En nøkkelfaktor som fører til tidlig platedegenerering er overdreven mekanisk lasting. Det intradiskale trykket til en stående ku i lumbal ryggraden er rundt 0,8 MPa med ryggraden justert horisontalt. Overraskende disse trykkene er sammenlignbare med lumbale intradiskale trykk rapportert for oppreist menneskelig ryggrad (0,5 MPa)15,16. Også mengden vann og proteoglykaner i storfeskiver er sammenlignbar med IVD fra unge mennesker17. Derfor, selv om bevegelsessegmentenes faktiske bevegelsesmønster kan variere i firedoble dyr fra bipedalmennesket, med hensyn til total lasting og skiveegenskaper, er kua mye nærmere menneskelig biologi enn andre etablerte dyremodeller for IVD som sauer og hunder.
I denne protokollen presenterer vi en teknikk for å analysere endringer i IVD fra romlig kondrocyttorganisasjon fra tidlig embryonal utvikling til sluttfase degenerasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av fluorescensmikroskopi forsterket av mosaikkavbildning og optisk seksjonering, evaluerte vi det romlige arrangementet av kondrocytter i anulus av lumbale IVD gjennom utvikling, modning og degenerasjon. Mens degenerativt vev kunne høstes fra pasienter som fikk ryggradskirurgi for skivedegenerering, krevde analyse av embryonal periode og modningsfase bruk av en modellorganisme (storfe). Høye cellulære tettheter ble notert i anulus under tidlig embryonal utvikling. I det videre utviklingsforløpet kunne man o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker våre medforfattere fra de opprinnelige publikasjonene for deres hjelp og støtte. Vi takker Charlotte Emma Bamberger for å ha bidratt til å skaffe apotome-bildene.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
