使用基底板和预先锚定物镜的微型镜进行小鼠钙瞬变研究
Summary
牙科水泥在固化过程中的收缩会取代底板。该协议通过创建牙科水泥的初始基础来最大程度地减少问题，从而留出空间来粘合底板。几周后，底板可以使用很少的新水泥粘合到该脚手架上的位置，从而减少收缩。
Abstract
神经科学家使用微型显微镜（微型显微镜）来观察行为自由的动物的神经元活动。加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Miniscope团队为研究人员提供开放资源，让他们自己构建微型镜。V3 UCLA Miniscope是目前使用的最流行的开源Miniscope之一。它允许通过植入浅表皮层的物镜（单透镜系统）对转基因神经元发出的荧光瞬变进行成像，或者通过植入深部大脑的中继透镜和预先锚定在微型镜中的物镜的组合在大脑深处区域成像，以观察中继图像（双镜头系统）。即使在最佳条件下（当神经元表达荧光指示剂并且中继透镜已正确植入时），水泥固化时底板及其与颅骨的连接之间的牙科水泥体积变化也会导致物镜和中继透镜之间距离改变的错位，从而导致图像质量差。底板是帮助将微型镜安装到头骨上并固定物镜和继电器透镜之间工作距离的板。因此，底板周围牙科水泥体积的变化会改变镜片之间的距离。本协议旨在最大限度地减少由牙科水泥体积变化引起的错位问题。该方案通过在中继晶状体植入期间建立牙科水泥的初始基础来减少错位。植入后的恢复时间足以使牙科水泥的基础完全固化底板，因此可以使用尽可能少的新水泥将底板粘合在该支架上。在本文中，我们描述了在小鼠中进行基底镀的策略，以便使用锚定在微型镜中的物镜对神经元活动进行成像。
Introduction
荧光活性报告基因是神经元活动成像的理想选择，因为它们灵敏且具有较大的动态范围1，2，3。因此，越来越多的实验使用荧光显微镜直接观察神经元活动1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16.第一台小型化单光子荧光显微镜（miniscope）由Mark Schnitzer等人于2011年设计5。该微型镜使研究人员能够监测行为自由的动物的小脑细胞的荧光动力学5（即，对动物没有任何物理约束，头部约束，镇静或麻醉）。目前，该技术可用于监测大脑浅表区域，例如皮层6，8，15，16;皮质下区域，如背侧海马体8、11、13、14 和纹状体6，17;和深部大脑区域，例如腹侧海马体 14、杏仁核10，18 和下丘脑8，12。
近年来，已经开发了几种开源微型示波器4,5,6,7,11,13,17,19.如果研究人员遵循加州大学洛杉矶分校（UCLA）微型望远镜团队提供的分步指南，则可以经济地组装微型镜4,7,11,13.因为神经活动的光学监测受到光传输限制的限制7 在感兴趣的神经元群体之间，设计了一个微型镜，该镜需要将物镜梯度折射率（GRIN）透镜（或物镜）预先锚定在微型镜的底部，以放大从中继GRIN透镜（或中继透镜）中继的视野6,7,8,10,16,17.该中继透镜被植入目标大脑区域，使得目标大脑区域的荧光活性被中继到中继透镜的表面上6,7,8,10,16,17.大约 1/4 的全正弦周期的光穿过物镜 GRIN 透镜（~ 0.25 间距）（图1A1），产生放大的荧光图像6,7.物镜并不总是固定在微型镜的底部，也不需要植入中继透镜6,7,11,13,15.具体来说，有两种配置：一种在微型镜中带有固定物镜，另一种在大脑中植入中继镜8,10,12,14,16 (图 1B1），另一个只有一个可拆卸的物镜6,7,11,13,15 (图1B2).在基于固定物镜和植入式中继透镜组合的设计中，来自大脑的荧光信号被带到中继透镜的顶部表面（图1A1)7,8,10,12,14,16.随后，物镜可以放大并透射来自中继透镜顶面的视野（图 1A2).另一方面，可拆卸物镜GRIN镜片设计更加灵活，这意味着将中继镜片预植入大脑不是强制性的（图1B2)6,7,11,13,15.当使用基于可拆卸物镜设计的微型镜时，研究人员仍然需要将晶状体植入目标大脑区域，但他们可以植入物镜6,7,11,13,15 或大脑中的中继透镜6,7.用于植入的物镜或中继透镜的选择决定了研究人员必须使用的微型镜配置。例如，V3 UCLA Miniscope基于可拆卸物镜GRIN镜头设计。研究人员可以选择直接在感兴趣的大脑区域植入物镜，并将“空”微型镜安装到物镜上。6,7,11,13,15 （单镜头系统; 图1B2）或在大脑中植入中继透镜并安装一个预先固定有物镜的微型镜6,7 （双镜头系统; 图 1B1).然后，微型镜用作荧光相机，以捕获由基因编码的钙指示剂产生的神经元荧光的实时图像1,2,3.将微型显微镜连接到计算机后，可以将这些荧光图像传输到计算机并保存为视频剪辑。研究人员可以通过分析一些分析包分析荧光的相对变化来研究神经元活动20,21 或编写代码以供将来分析。
V3 UCLA Miniscope为用户提供了灵活性，可以确定是使用单镜头还是双镜头系统对神经元活动进行成像7。记录系统的选择基于目标大脑区域的深度和大小。简而言之，单透镜系统只能对表面（小于约2.5毫米深）和相对较大的区域（大于约1.8 x 1.8 mm2）进行成像，因为制造商只生产一定尺寸的物镜。相比之下，双镜片系统可以应用于任何目标大脑区域。然而，用于粘合底板的牙科水泥往往会因物镜和中继透镜之间的距离改变而造成错位，从而导致图像质量差。如果使用双镜头系统，则需要精确定位两个工作距离，以实现最佳成像质量（图1A）。这两个关键的工作距离位于继电器透镜的神经元和底表面之间，以及中继透镜的顶表面和物镜的底表面之间（图1A1）。镜头在工作距离之外的任何错位或错位都会导致成像失败（图1C2）。相比之下，单透镜系统只需要一个精确的工作距离。然而，物镜尺寸限制了其用于监测脑深部区域的应用（适合微型镜的物镜约为1.8~2.0mm6，11，13，15）。因此，物镜的植入仅限于观察小鼠11，13的表面和相对较大的脑区域，例如皮层6，15和背角氨1（CA1）。此外，必须吸出大面积的皮层以靶向背侧CA111，13。由于单透镜配置的限制，无法对脑深部区域成像，商用微型镜系统仅提供组合物镜/中继透镜（双透镜）设计。另一方面，V3 UCLA微型镜可以修改为单镜头或双镜头系统，因为它的物镜是可拆卸的6，11，13，15。换句话说，V3 UCLA微型镜用户可以利用可拆卸镜头，将其植入大脑（创建单镜头系统），在进行涉及浅表大脑观察的实验（深度小于2.5毫米）时，或者将其预先固定在微型镜中并在大脑中植入中继镜头（创建双镜头系统）， 在进行涉及深部大脑观察的实验时。双透镜系统也可以应用于浅表观察大脑，但研究人员必须知道物镜和中继透镜之间的精确工作距离。单镜头系统的主要优点是，与双镜头系统相比，错过工作距离的机会更低，因为需要精确定位两个工作距离才能在双镜头系统中实现最佳成像质量（图1A）。因此，我们建议使用单镜头系统进行浅表大脑观察。但是，如果实验需要在深部大脑区域成像，研究人员必须学会避免两个镜头错位。
用于实验的微型镜的双透镜配置的基本协议包括透镜植入和基底电镀8，10，16，17。基底板是将底板粘在动物的头部上，以便微型镜最终可以安装在动物的顶部，并对神经元的荧光信号进行录像（图1B）。该过程涉及使用牙科水泥将底板粘在颅骨上（图1C），但是牙科水泥的收缩会导致植入的中继透镜和物镜之间的距离发生不可接受的变化8，17。如果两个镜头之间的偏移距离太大，则无法聚焦细胞。
使用微型镜进行深部脑钙成像实验的详细方案已经发表8,10,16,17.这些协议的作者使用了Inscopix系统8,10,16 或其他定制设计17 并描述了病毒选择、手术和底板附着的实验程序。但是，它们的协议不能精确地应用于其他开源系统，例如V3 UCLA Miniscope系统，NINscope。6和芬奇镜19.在加州大学洛杉矶分校Miniscope的双镜头配置中，由于用于将底板粘合到颅骨上的牙科水泥的类型，在使用UCLA Miniscope的双镜头配置中，两个镜头可能会发生错位8,17 (图1C).需要本方案，因为植入的中继透镜和物镜之间的距离容易由于基底铺设过程中牙科水泥的不良收缩而发生偏移。在基底镀过程中，必须通过调整微型镜和继电器透镜顶部之间的距离来找到植入式中继透镜和物镜之间的最佳工作距离，然后将底板粘合在这个理想位置。在物镜和植入的中继透镜之间设置正确的距离后，可以在蜂窝分辨率（图1B; in vivo 录音）。由于中继透镜的最佳工作距离范围很小（50 – 350 μm）4,8，固化过程中水泥过度收缩会使物镜和植入的中继镜难以保持在适当的范围内。本报告的总体目标是提供一个减少收缩问题的协议8,17 在基底电镀过程中发生，并提高双透镜配置中荧光信号的微型镜记录的成功率。成功的微型镜记录被定义为记录自由行为的动物中单个神经元荧光的显着相对变化的实时流。虽然不同品牌的牙科水泥收缩率不同，但研究人员可以选择以前测试过的品牌6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22.然而，由于医疗材料的进口规定，并非每个品牌在某些国家/地区都容易获得。因此，我们开发了测试可用牙科水泥收缩率的方法，重要的是，提供了一种替代方案，可以最大限度地减少收缩问题。与目前的基底电镀方案相比，其优点是提高了使用工具和水泥进行钙成像的成功率，这可以在实验室中轻松获得。加州大学洛杉矶分校微型镜用作示例，但该协议也适用于其他微型镜。在本报告中，我们描述了一种优化的基底电镀程序，并推荐了一些安装加州大学洛杉矶分校微型镜双透镜系统（图2A).介绍了使用加州大学洛杉矶分校微型镜进行双透镜配置的成功植入示例（n = 3只小鼠）和植入失败的示例（n = 2只小鼠），并讨论了成功和失败的原因。
Protocol
Representative Results
Discussion
本报告描述了使用双镜头加州大学洛杉矶分校Miniscope系统的研究人员的详细实验方案。对于任何希望尝试体内钙成像的实验室来说，我们协议中设计的工具相对实惠。一些方案，如病毒注射、晶状体植入、假基底板和基底板，也可用于其他版本的微型镜系统，以提高钙成像的成功率。除了病毒注射和镜头植入的普遍问题（无论微型镜版本如何）都需要固定外，UCLA底板的结构可能会导致位置…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了台湾科学技术部（108-2320-B-002 -074，109-2320-B-002-023-MY2）的支持。
Materials
| 0.7-mm drill bit | #19008-07 | Fine Science Tools; USA | for surgery |
| 0.1–10 μl pipette tips | 104-Q; QSP | Fisher Scientific; Singapore | for testing dental cement |
| 20 G IV cathater | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| 27 G needle | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation; Tokyo, Japan | for surgery |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep; MA, USA | for viral injection |
| Atropine sulfate | Astart; Hsinchu, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Baseplate | V3 | http://miniscope.org | for dummy baseplating/baseplating |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA | Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Bone Rongeur Friedman | 13 cm | Diener; Tuttlingen, Germany | for baseplating |
| Buprenorphine | INDIVIOR; UK | for surgery | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis; Exton, PA | analgesia |
| Ceftazidime | Taiwan Biotech; Taiwan | prevent infection | |
| Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | for baseplating | |
| Dental cement set | Tempron | GC Corp; Tokyo, Japan | for testing dental cement |
| Dental cement set | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan | for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors | #51673 | Stoelting Co; Illinois, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Duratear ointment | Alcon; Geneva, Switzerland | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Ibuprofen | YungShin; Taiwan | analgesia | |
| Isoflurane | Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Inscopix | nVista System | Inscopix; Palo Alto, CA | for comparison with V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizer; NY, NY | for euthanasia | |
| Normal saline | for surgery | ||
| Micro bulldog clamps | #12.102.04 | Dimedo; Tuttlingen, Germany | for lens implantation |
| Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge | #88400 | Hamilton; Bonaduz, Switzerland | for viral injection |
| Molding silicone rubber | ZA22 Thixo | Zhermack; Badia Polesine, Italy | for dummy baseplating |
| Objective Gradient index (GRIN) lens | #64519 | Edmund Optics; NJ, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Parafilm | #PM996 | Bemis; Neenah, USA | for dummy baseplating |
| Portable Suction | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan | for surgery |
| Relay GRIN lens | #1050-002177 | Inscopix; Palo Alto, CA, USA | for dummy baseplating/baseplating |
| Stainless steel anchor screws | 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm | for surgery | |
| Stereo microscope | #SL720 | Sage Vison; New Taipei City, Taiwan | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting; IL, USA | for surgery/dummy baseplating/baseplating |
| UV Cure Adhesive | #3321 | Loctite; Düsseldorf, Germany | for testing dental cement |
| V3 UCLA Miniscope | purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | for surgery/dummy baseplating/baseplating | |
| Xylazine | X1126 | Sigma-Aldrich; St. Louis, MO | for euthanasia |
| Xylocaine pump spray 10% | AstraZeneca; Södertälje, Sweden | for surgery |
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