乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル
Summary
乳がん脳転移細胞の薬物および放射線応答を器官型脳スライスモデルでリアルタイムに測定するためのプロトコルを紹介します。本方法は、脳微小環境界面内での乳癌からの脳転移に対する様々な治療の治療効果を ex vivo 方式で調査するための定量的アッセイを提供する。
Abstract
脳転移は、これらの腫瘍が治療が困難であり、臨床転帰不良と関連しているため、女性にとって乳癌の重篤な結果である。乳癌脳転移(BCBM)増殖の前臨床マウスモデルは有用であるが高価であり、脳実質内での生細胞および腫瘍細胞浸潤を追跡することは困難である。ここに提示されるのは、頭蓋内注射された乳癌脳シーククローンサブラインを含む異種移植マウスからの ex vivo 脳スライス培養のためのプロトコールである。 MDA-MB-231BR ルシフェラーゼタグ付き細胞をNu/Nu雌マウスの脳に頭蓋内注射し、腫瘍形成後、脳を単離、スライス、 エクスビボで培養した。腫瘍スライスを画像化して、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を同定し、脳実質におけるそれらの増殖および浸潤を最大10日間モニターした。さらに、このプロトコルは、電離放射線または化学療法による治療後の腫瘍細胞の増殖および浸潤挙動を画像化するためのタイムラプス顕微鏡の使用を記載している。治療に対する腫瘍細胞の応答は、ライブイメージング顕微鏡、生物発光強度の測定、およびBCBM細胞を含む脳スライスの組織学の実施によって視覚化することができる。したがって、この エキソビボ スライスモデルは、脳微小環境内の個々の患者の乳癌脳転移増殖を標的とするようにパーソナライズされた薬物を同定するために、新規治療薬を単独で、または放射線と組み合わせて迅速に試験するための有用なプラットフォームであり得る。
Introduction
乳がんの脳転移(BCBM)は、原発性乳房腫瘍から脳に細胞が広がると発症します。乳がんは、肺がんに次いで脳転移の2番目に頻繁な原因であり、転移は患者の10〜16%で起こる1。残念なことに、患者の>80%が脳転移診断後1年以内に死亡し、神経機能障害のために生活の質が損なわれているため、脳転移は依然として不治の病のままです2。より効果的な治療選択肢を特定することが急務です。単層二次元または三次元培養モデルは、実験室で治療薬を試験する際に最も一般的に使用される方法である。しかし、それらは、腫瘍表現型および増殖の主要な要因である複雑なBCBM微小環境を模倣していない。これらのモデルは有用であるが、腫瘍の複雑な間質相互作用、固有の代謝要求、および腫瘍の不均一性を捉えていない3。腫瘍間質相互作用と微小環境の不均一性をより忠実に再現するために、我々のグループと他のグループは、患者由来の腫瘍細胞(原発性または転移性)または癌細胞株を用いて有機型脳転移「スライス」培養物を生成し始めている4,5,6。古典的なin vitroシステムと比較して、この短期のex vivoモデルは、大型動物コホートにおける前臨床評価の前に新しい治療法をスクリーニングするためのより関連性の高い条件を提供する可能性がある。
エクスビボモデルは、主に様々な癌の成功した治療法の同定のために構築され、首尾よく使用されてきた。評価には数日が必要であり、さらに患者固有の薬物スクリーニングに合わせて調整することができます。例えば、ヒト膀胱および前立腺癌エクスビボ組織は、ドセタキセルおよびゲムシタビンの用量依存的な抗腫瘍応答を示している7。同様の結腸直腸癌のエクスビボ組織が、化学療法薬オキサリプラチン、セツキシマブ、およびペムブロリズマブ8をスクリーニングするために開発された。この用途は、間質環境と膵管腺癌の遺伝子型および表現型特性との間の本質的な相互作用を考慮して、膵臓癌において広く使用されている9,10。さらに、このような有機型モデルが、頭部、頸部、胃、および乳房腫瘍における同様のスクリーニングのために開発されている11、12。
ここで、異種移植乳癌脳転移性腫瘍細胞のエクスビボ脳スライスモデルをそれらの微小環境において生成させている。マウスに乳癌脳転移性脳栄養性MDA-MB-231BR細胞13を大脳皮質頭頂葉-TNBC転移14、15の共通部位に頭蓋内注射し、腫瘍を発症させた。脳スライスを、これらの異種移植動物から生成し、16、17に記載のように器官型培養物としてエクスビボで維持した。この新規なエクスビボモデルは、脳実質内のBCBM細胞の成長の分析を可能にし、脳微小環境内の腫瘍細胞に対する治療薬および放射線効果の試験に使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、外植異種移植片脳腫瘍のための新規なex vivo 脳培養方法を確立する。我々は、マウスの脳に頭蓋内注射されたBCBM細胞MDA-MB-231BR細胞が 、エクスビボ 脳スライス中で生存および増殖し得ることを示す。この研究はまた、頭蓋内注射されたU87MG膠芽腫(GBM)細胞を試験し、これらの癌細胞が脳スライスで生き残り、増殖することも見出した(データは示されていない)。この?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジュリア・ファーナン、ケイラ・グリーン、ティツィアナ・デアンジェリスの技術支援に感謝します。この研究は、ペンシルベニア州ユニバーサル研究強化助成金プログラム(MJR、JGJ)、UO1CA244303(MJR)、R01CA227479(NLS)、R00CA207855(EJH)、およびW.W. Smith Charitable Trusts(EjH)によって部分的に支援されました。
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
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