Un modèle de tranche cérébrale ex vivo pour étudier et cibler la croissance tumorale métastatique du cancer du sein
Summary
Nous introduisons un protocole pour mesurer en temps réel la réponse médicamenteuse et radiologique des cellules métastatiques du cerveau du cancer du sein dans un modèle organotypique de tranches cérébrales. Les méthodes fournissent un test quantitatif pour étudier les effets thérapeutiques de divers traitements sur les métastases cérébrales du cancer du sein de manière ex vivo dans l’interface du microenvironnement cérébral.
Abstract
Les métastases cérébrales sont une conséquence grave du cancer du sein chez les femmes, car ces tumeurs sont difficiles à traiter et sont associées à de mauvais résultats cliniques. Les modèles murins précliniques de croissance métastatique du cerveau du cancer du sein (BCBM) sont utiles mais coûteux, et il est difficile de suivre les cellules vivantes et l’invasion des cellules tumorales dans le parenchyme cérébral. Présenté ici est un protocole pour les cultures de tranches de cerveau ex vivo de souris xénogreffées contenant des sous-lignées clonales de cancer du sein injectées par voie intracrânienne. Les cellules marquées par la luciférase MDA-MB-231BR ont été injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris femelles Nu / Nu, et après la formation de tumeurs, les cerveaux ont été isolés, tranchés et cultivés ex vivo. Les tranches tumorales ont été imagées pour identifier les cellules tumorales exprimant la luciférase et surveiller leur prolifération et leur invasion dans le parenchyme cérébral pendant 10 jours. En outre, le protocole décrit l’utilisation de la microscopie time-lapse pour imager la croissance et le comportement invasif des cellules tumorales après un traitement par rayonnement ionisant ou chimiothérapie. La réponse des cellules tumorales aux traitements peut être visualisée par microscopie d’imagerie en direct, en mesurant l’intensité de la bioluminescence et en effectuant une histologie sur la tranche de cerveau contenant des cellules BCBM. Ainsi, ce modèle de tranche ex vivo peut être une plate-forme utile pour tester rapidement de nouveaux agents thérapeutiques seuls ou en combinaison avec des radiations afin d’identifier des médicaments personnalisés pour cibler la croissance métastatique du cerveau du cancer du sein d’une patiente individuelle dans le microenvironnement cérébral.
Introduction
Les métastases cérébrales du cancer du sein (BCBM) se développent lorsque les cellules se propagent de la tumeur mammaire primaire au cerveau. Le cancer du sein est la deuxième cause la plus fréquente de métastases cérébrales après le cancer du poumon, avec des métastases survenant chez 10 à 16% des patientes1. Malheureusement, les métastases cérébrales restent incurables car >80% des patients meurent dans l’année suivant leur diagnostic de métastases cérébrales et leur qualité de vie est altérée en raison de dysfonctionnements neurologiques2. Il est urgent d’identifier des options de traitement plus efficaces. Les modèles de culture monocouches bidimensionnelles ou tridimensionnelles sont les méthodes les plus couramment utilisées pour tester les agents thérapeutiques en laboratoire. Cependant, ils n’imitent pas le microenvironnement complexe BCBM, un moteur majeur du phénotype et de la croissance de la tumeur. Bien que ces modèles soient utiles, ils ne capturent pas les interactions complexes tumeur-stromale, les besoins métaboliques uniques et l’hétérogénéité des tumeurs3. Pour récapituler plus fidèlement les interactions tumeur-stromale et l’hétérogénéité du microenvironnement, notre groupe et d’autres ont commencé à générer des cultures de métastases cérébrales organotypiques en « tranches » avec des cellules tumorales dérivées du patient (primaires ou métastatiques) ou des lignées cellulaires cancéreuses 4,5,6. Comparé aux systèmes in vitro classiques, ce modèle ex vivo à court terme peut fournir des conditions plus pertinentes pour le dépistage de nouveaux traitements avant l’évaluation préclinique dans les grandes cohortes d’animaux.
Des modèles ex vivo ont été construits et utilisés avec succès principalement pour l’identification de traitements efficaces de divers cancers. Ils nécessitent quelques jours d’évaluation et peuvent en outre être adaptés au dépistage de médicaments spécifiques au patient. Par exemple, les tissus ex vivo du cancer de la vessie et de la prostate humains ont montré une réponse antitumorale dose-dépendante du docétaxel et de la gemcitabine7. Des tissus ex vivo similaires au carcinome colorectal ont été développés pour dépister les médicaments chimiothérapeutiques Oxaliplatin, Cetuximab et Pembrolizumab8. Cette application a été largement utilisée dans le cancer du pancréas, compte tenu de l’interaction essentielle entre l’environnement stromal et les caractéristiques génotypiques et phénotypiques de l’adénocarcinome canalaire pancréatique 9,10. En outre, de tels modèles organotypiques ont été développés pour des dépistages similaires dans les tumeurs de la tête, du cou, de l’estomac et du sein11,12.
Ici, un modèle de tranche de cerveau ex vivo de cellules tumorales métastatiques du cancer du sein xénogreffées dans leur microenvironnement est généré. Des souris ont été injectées par voie intracrânienne avec des cellules MDA-MB-231BR trophiques métastatiques du cerveau du cancer du sein13 dans le lobe pariétal du cortex cérébral – un site commun de métastases du CSTN14,15 et ont permis de développer des tumeurs. Des tranches de cerveau ont été générées à partir de ces animaux xénogreffés et maintenues ex vivo sous forme de cultures organotypiques comme décrit16,17. Ce nouveau modèle ex vivo permet d’analyser la croissance des cellules BCBM dans le parenchyme cérébral et peut être utilisé pour tester les agents thérapeutiques et les effets des radiations sur les cellules tumorales dans le microenvironnement cérébral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude établit une nouvelle méthode de culture cérébrale ex vivo pour les tumeurs cérébrales explantées de xénogreffes. Nous montrons que les cellules BCBM MDA-MB-231BR injectées par voie intracrânienne dans le cerveau de souris peuvent survivre et se développer dans des tranches de cerveau ex vivo . L’étude a également testé des cellules de glioblastome U87MG (GBM) injectées par voie intracrânienne et a également constaté que ces cellules cancéreuses survivent et se développ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Julia Farnan, Kayla Green et Tiziana DeAngelis pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par le Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) et W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
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