विस्तार और गामा-डेल्टा का संवर्धन (ππ) T कोशिकाओं Apheresed मानव उत्पाद से
Summary
प्रस्तुत गामा-डेल्टा के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल है (ππ) टी सेल दवा उत्पाद। लिम्फोसाइटों को एल्यूट्रियेशन द्वारा अलग किया जाता है और ज़ोलेड्रोनिक एसिड और इंटरल्यूकिन -2 के साथ समृद्ध होता है। अल्फा-बीटा टी कोशिकाओं को नैदानिक-ग्रेड चुंबकीय पृथक्करण उपकरण का उपयोग करके समाप्त कर दिया जाता है। कोशिकाओं को K562-व्युत्पन्न, कृत्रिम एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत किया जाता है और विस्तारित किया जाता है।
Abstract
हालांकि Vπ9Vπ2 टी कोशिकाएं टी लिम्फोसाइट्स का एक मामूली सबसेट हैं, इस आबादी को एक प्रमुख हिस्टोकंपैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) में एंटीजन को पहचानने की क्षमता के लिए मांग की जाती है – स्वतंत्र तरीके से और मजबूत साइटोलाइटिक प्रभावक फ़ंक्शन विकसित करना जो इसे कैंसर इम्यूनोथेरेपी के लिए एक आदर्श उम्मीदवार बनाता है। परिधीय रक्त में गामा-डेल्टा (ππ) टी कोशिकाओं की कम आवृत्ति के कारण, हमने तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) वाले रोगियों में एलोजेनिक टी कोशिकाओं के पहले-इन-ह्यूमन उपयोग के लिए एक अत्यधिक शुद्ध टी कोशिकाओं की दवा उत्पाद का विस्तार करने के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित किया है। एक एलोजेनिक सेल स्रोत के रूप में स्वस्थ दाता एफेरेसिस का उपयोग करते हुए, लिम्फोसाइट्स को आकार और घनत्व द्वारा कोशिकाओं को अलग करने की एक काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन विधि के लिए एक मान्य डिवाइस का उपयोग करके अलग किया जाता है।
लिम्फोसाइट-समृद्ध अंश का उपयोग किया जाता है, और 7 दिनों के लिए ज़ोलेड्रोनिक एसिड (एफडीए-अनुमोदित) और इंटरल्यूकिन (आईएल) -2 के साथ ज़ोलेड्रोनिक एसिड (एफडीए-अनुमोदित) और इंटरल्यूकिन (आईएल) -2 के साथ अधिमानतः सक्रिय किया जाता है। टी कोशिकाओं के अधिमान्य विस्तार के बाद, एक नैदानिक-ग्रेड चुंबकीय सेल-पृथक्करण उपकरण और टीसीआरα π मोतियों का उपयोग दूषित टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को कम करने के लिए किया जाता है। अत्यधिक समृद्ध टी कोशिकाएं तब K562 कोशिकाओं से व्युत्पन्न इंजीनियर कृत्रिम एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं (एएपीसी) का उपयोग करके एक दूसरे विस्तार से गुजरती हैं- आनुवंशिक रूप से सीडी 3 और सीडी 28, 41 बीबीएल (सीडी 137 एल) और आईएल 15-आरए-ज़ोलेड्रोनिक एसिड और आईएल -2 के साथ एकल-श्रृंखला चर टुकड़ा (एससीएफवी) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। एएपीसी के साथ सह-संस्कृति में पूरे दिन-7 समृद्ध टी कोशिकाओं को सीडिंग करने से स्वस्थ दाता रक्त से >29,000 गुना के औसत गुना विस्तार के साथ अत्यधिक शुद्ध π टी कोशिकाओं के निर्माण की सुविधा मिलती है।
Introduction
ल्यूकेमिया रिलैप्स एएमएल 1,2,3 वाले रोगियों में हेमटोपोइएटिक सेल ट्रांसप्लांटेशन (एचसीटी) के बाद मृत्यु दर का प्रमुख कारण है। बेहतर ल्यूकेमिया मुक्त उत्तरजीविता को ग्राफ्ट-बनाम-होस्ट रोग (जीवीएचडी) 4 के बढ़ते जोखिम के बिना एचसीटी के बाद रक्त की बढ़ी हुई वसूली के साथ सूचित किया गया था। एक MHC-स्वतंत्र तरीके से एंटीजन को पहचानने और मजबूत साइटोलाइटिक और Th1-जैसे प्रभावकारी कार्यों को विकसित करने के लिए टी कोशिकाओं की इस छोटी उप-आबादी को एएमएल रोगियों के उपचार के लिए आदर्श बनाती है, जो एलोजेनिक प्रत्यारोपण से गुजरने वाले एएमएल रोगियों के उपचार के लिए आदर्श है। यह देखते हुए कि Vπ9Vπ2 टी कोशिकाएं टी लिम्फोसाइट्स का एक मामूली सबसेट हैं जो परिधि 6 में टी कोशिकाओं के 0.5% से 5% तक होती हैं, हम नैदानिक परीक्षणों के लिए संभावित चिकित्सीय खुराक प्राप्त करने के लिए रक्त कोशिकाओं की इस दुर्लभ आबादी का विस्तार करने के लिए एक मजबूत प्रणाली स्थापित करने के लिए तैयार हैं।
यद्यपि अन्य लोगों ने ज़ोलेड्रोनिक एसिड और यहां तक कि एएपीसी का उपयोग करके सफलतापूर्वक टी कोशिकाओं का विस्तार किया है, हमने एक ऐसी प्रक्रिया विकसित की है जो संभावित रूप से 229,749 गुना तक टी कोशिकाओं का विस्तार कर सकती है। विस्तार biphasic है: सबसे पहले, लिम्फोसाइटों पृथक्करण उपकरण का उपयोग करके elutriation द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। उपकरण एक बंद प्रणाली प्रदान करता है जो कोशिकाओं के आकार, आकार और घनत्व के आधार पर काउंटरफ्लो सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पृथक्करण की अनुमति देता है। लिम्फोसाइटों के लिए समृद्ध करने के बाद, Vπ9Vπ2 T कोशिकाओं का चयनात्मक विस्तार zoledronic एसिड और IL-2 के साथ 7 दिनों के लिए उपचार द्वारा प्राप्त किया जाता है। इस उपचार के तुरंत बाद, TCR-απ T कोशिकाओं को माइक्रोबीड तकनीक का उपयोग करके समाप्त कर दिया जाता है, जिससे K562-व्युत्पन्न aAPCs के साथ T कोशिकाओं के बाद के विस्तार की अनुमति मिलती है।
प्रक्रिया सत्यापन के लिए, एएपीसी के साथ चरण -2 सह-संस्कृति विस्तार के लिए केवल 5 × 106 ज़ोलेड्रोनिक एसिड-विस्तारित टी कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। विस्तार के इस दूसरे चरण में, मोफिट में निर्मित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर K562-व्युत्पन्न aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) के वर्तमान गुड मैन्युफैक्चरिंग प्रैक्टिसेस (cGMP)-अनुरूप वर्किंग सेल बैंक (WCB) का उपयोग करके टी कोशिकाओं को सक्रिय किया जाता है। इस बिफैसिक विस्तार का तर्क मोनोसाइट्स में फ़ार्नेसिल डाइफॉस्फेट सिंथेज़ (एफडीपीएस) को बाधित करने के लिए ज़ोलेड्रोनिक एसिड की क्षमता पर आधारित है, जिससे आइसोपेंटेनिल पायरोफॉस्फेट का संचय होता है, जो सीधे वी2वी 2 कोशिकाओं को उत्तेजित करता है। विस्तार के दूसरे चरण में, K562-व्युत्पन्न aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) सभी टी कोशिकाओं के लिए एक मजबूत उत्तेजना प्रदान करते हैं। हालांकि, सेल उत्पाद को पहले से ही π T कोशिकाओं के लिए समृद्ध किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप π T कोशिकाओं का एक मजबूत विस्तार होता है।
विशिष्ट उपकरणों और फ्लास्क के उपयोग के साथ, प्रक्रिया एक कार्यात्मक रूप से बंद प्रणाली है, इस प्रकार संदूषण के जोखिम को कम करती है। इसके अलावा, 1 एल बंद-प्रणाली बायोरिएक्टर अधिकतम विकास और 1 एल माध्यम की कुल मात्रा में कोशिकाओं के विस्तार की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें खिलाने की न्यूनतम आवश्यकता होती है। मोफिट विधि का लाभ यह है कि यह एलोजेनिक प्रशासन के लिए एक अत्यधिक शुद्ध, दाता-व्युत्पन्न टी सेल उत्पाद का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से, पुन: प्रस्तुत करने योग्य और अत्यधिक व्यवहार्य जीएमपी प्रणाली प्रदान करता है। इस विधि को किसी भी नैदानिक परीक्षण पर लागू किया जा सकता है जिसका उद्देश्य आंशिक और पूर्ण छूट के साथ कैंसर रोगियों में रोगाणुओं और ट्यूमर के खिलाफ प्रतिरक्षा की मध्यस्थता करने के लिए दत्तक इम्यूनोथेरेपी के रूप में वी2वी 2 टी सेल रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाली मानव कोशिकाओं का उपयोग करना है। इसके अलावा, यह विकास और उत्पादन के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर-पॉजिटिव (CAR+) टी कोशिकाओं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मोफिट सेल थेरेपी लैब ने नैदानिक परीक्षणों में डीपी के रूप में उपयोग के लिए अत्यधिक शुद्ध टी कोशिकाओं के एक बिफैसिक विस्तार के साथ एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह प्रोटोकॉल एक बंद प्रणाली में cGMP दिशानिर्देशों के तहत एक विनिर्माण विधि प्रदान करता है जो एक अत्यधिक शुद्ध टी सेल डीपी उत्पन्न करता है जो सफलतापूर्वक सक्रिय और zoledronic एसिड और WCB aAPCs द्वारा विस्तारित होता है। इस प्रोटोकॉल को एएमएल रोगियों के लिए एक एलोजेनिक टी सेल डीपी के निर्माण के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित किया गया है। स्वस्थ दाताओं का उपयोग करते हुए, हमने सफलतापूर्वक 2.06 से 0.45% ± ± 28.34% तक 54.45% तक केवल 7 दिनों में दाता की छोटी आबादी का विस्तार किया। ज़ोलेड्रोनिक एसिड के साथ 7-दिवसीय विस्तार के बाद, यह देखा गया कि दाता 2 में एनके आबादी में वृद्धि हुई थी।
ज़ोलेड्रोनिक एसिड मोनोसाइट्स में फार्नेसिल डाइफॉस्फेट सिंथेज़ (एफडीपीएस) को रोकता है, जो बदले में, आइसोपेन्टेनिल पायरोफॉस्फेट (आईपीपी) के संचय की ओर जाता है, जिसे टी कोशिकाओं और प्राकृतिक एनके कोशिकाओं के प्रसार में महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ सहसंबद्ध किया गया है7,8,9। यह बढ़ी हुई एनके आबादी एएपीसी के साथ विस्तार के दूसरे चरण में बाधा डालती है, क्योंकि एएपीसी केवल एनके कोशिकाओं के आगे के विस्तार में योगदान देगा। इस कारण से, दाता मानदंडों को उच्च एनके आबादी वाले दाताओं को बाहर करने के लिए संशोधित किया गया था। απ T कोशिकाओं की कमी के बाद, π π T कोशिकाओं को 76.61 ± 27.51% तक और समृद्ध किया गया था। इस अद्वितीय प्रोटोकॉल में एक दूसरा विस्तार शामिल है जो मोफिट-निर्मित एएपीसी का उपयोग करके CD8, CD28, और CD127L रिसेप्टर्स को लक्षित करने के लिए है। एएपीसी के साथ इस दूसरे विस्तार चरण ने CD3 + TCR के लिए ≥65% के साथ एक DP प्राप्त किया, ≤1% TCRαπ T, और <35% CD3-CD16 + CD56 + NK कोशिकाओं के लिए। K562-व्युत्पन्न aAPCs के उपयोग के कारण, यह प्रदर्शित करना आवश्यक था कि इन aAPCs में अंतिम उत्पाद का <1% शामिल था।
Moffit CTF एक प्रवाह cytometric परख अंतिम डीपी में अवशिष्ट K562 कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने के लिए रिलीज मानदंड के लिए इस्तेमाल किया विकसित किया. इस प्रवाह cytometric परख K562 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सेल सतह एंटीजन का उपयोग करने के सभी मुद्दों को कम करता है। जैसा कि सक्रिय टी कोशिकाएं सीडी 71 को व्यक्त कर सकती हैं, हमने सीडी 3– सीडी 56- और सीडी 16– आबादी पर गेटिंग करके और फिर सीडी 71 + कोशिकाओं की जांच करके सभी टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक रणनीति तैयार की, जो विशेष रूप से K562 कोशिकाएं होंगी। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि π टी सेल डीपी अवशिष्ट K562 कोशिकाओं के 0.48 ± 0.42% उपज और ≥70% व्यवहार्यता, पीसीआर द्वारा माइकोप्लाज्मा नकारात्मकता के सभी रिलीज मानदंडों को पूरा करता है, ग्राम धुंधला द्वारा कोई जीव नहीं देखा जाता है, एंडोटॉक्सिन के ≤2 यूरोपीय संघ / एमएल, और कोई विकास अंतिम (14 दिन) रक्त संस्कृति बाँझपन नहीं।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल विकास के लिए धन प्रदान करने के लिए मॉफिट कैंसर सेंटर से सेलुलर इम्यूनोथेरेपी-अन्वेषक शुरू किए गए परीक्षण पुरस्कार इंट्राम्यूरल फंडिंग अवसर को धन्यवाद देते हैं। हम इस परियोजना के माध्यम से उनकी अमूल्य सहायता और मार्गदर्शन के लिए डॉ क्लाउडियो अनासेटी को भी धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम अपनी अंतर्दृष्टि और पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ जस्टिन बाउचर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
| Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04–8 | FDA approved drug |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 100 mL syringe | JMS | 992861 | |
| 18g Needle | Fisher | 305198 | |
| Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
| 5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
| 50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
| 10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
| 100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 mL conical | Fisher | 430776 | |
| 600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
| Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
| 1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
| Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
| CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
| AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
| Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
| HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |
References
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