Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Summary

Présenté est un protocole pour l’expansion du produit médicamenteux Gamma-Delta (γδ) T cell. Les lymphocytes sont isolés par élutriation et enrichis en γδ en acide zolédronique et en interleukine-2. Les lymphocytes T alpha-bêta sont épuisés à l’aide d’un dispositif de séparation magnétique de qualité clinique. Les cellules γδ sont co-cultivées avec des cellules productrices d’antigènes artificiels dérivées de K562 et expansées.

Abstract

Bien que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 soient un sous-ensemble mineur des lymphocytes T, cette population est recherchée pour sa capacité à reconnaître les antigènes d’une manière indépendante du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et à développer une forte fonction effectrice cytolytique qui en fait un candidat idéal pour l’immunothérapie du cancer. En raison de la faible fréquence des lymphocytes T Gamma-Delta (γδ) dans le sang périphérique, nous avons développé un protocole efficace pour développer considérablement un produit médicamenteux à base de lymphocytes T γδ très pur pour la première utilisation chez l’homme de lymphocytes T γδ allogéniques chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM). En utilisant l’aphérèse de donneur sain comme source de cellules allogéniques, les lymphocytes sont isolés à l’aide d’un dispositif validé pour une méthode de centrifugation à contre-courant de séparation des cellules par taille et densité.

La fraction riche en lymphocytes est utilisée et les lymphocytes T γδ sont activés préférentiellement avec de l’acide zolédronique (approuvé par la FDA) et de l’interleukine (IL)-2 pendant 7 jours. Suite à l’expansion préférentielle des lymphocytes T γδ, un dispositif de séparation magnétique des cellules de qualité clinique et des billes TCRαβ sont utilisés pour épuiser les cellules T contaminantes du récepteur des lymphocytes T (TCR)αβ. Les lymphocytes T γδ hautement enrichis subissent ensuite une deuxième expansion à l’aide de cellules artificielles présentatrices d’antigènes (APAC) modifiées à partir de cellules K562 génétiquement modifiées pour exprimer un fragment variable à chaîne unique (scFv) pour CD3 et CD28, 41BBL (CD137L) et IL15-RA- avec de l’acide zolédronique et de l’IL-2. L’ensemencement de tous les lymphocytes T γδ enrichis jour-7 en co-culture avec les aPAC facilite la fabrication de lymphocytes T γδ très purs avec une expansion moyenne du pli de 229 000 fois > à partir de sang de donneur sain.

Introduction

La rechute de la leucémie est la principale cause de mortalité après greffe de cellules hématopoïétiques (HCT) chez les patients atteints de LAM1,2,3. Une meilleure survie sans leucémie a été rapportée avec une récupération accrue des lymphocytes T γδ sanguins après HCT sans risque accru de maladie du greffon contre l’hôte (GVH)⁴. La capacité des lymphocytes T γδ à reconnaître les antigènes indépendamment du CMH et à développer de fortes fonctions effectrices cytolytiques et de type Th1 rend cette sous-population mineure de lymphocytes T idéale pour le traitement des patients atteints de LAM subissant une transplantation allogénique à risque de rechute5. Étant donné que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 sont un sous-ensemble mineur de lymphocytes T allant de 0,5 % à 5 % des lymphocytes T de la ^{périphérie6}, nous avons entrepris d’établir un système robuste pour élargir cette population rare de cellules sanguines afin d’obtenir des doses potentiellement thérapeutiques pour les essais cliniques.

Bien que d’autres aient réussi à étendre les lymphocytes T γδ en utilisant de l’acide zolédronique et même des aPAC, nous avons développé un processus qui peut potentiellement multiplier par 229 749 les lymphocytes T γδ. L’expansion est biphasique : tout d’abord, les lymphocytes sont obtenus par élutriation à l’aide de l’instrument de séparation. L’équipement fournit un système fermé qui permet la séparation des cellules en fonction de leur taille, de leur forme et de leur densité par centrifugation à contre-courant. Après enrichissement pour les lymphocytes, l’expansion sélective des lymphocytes T Vγ9Vδ2 est obtenue par traitement à l’acide zolédronique et à l’IL-2 pendant 7 jours. Immédiatement après ce traitement, les lymphocytes TCR-αβ sont épuisés à l’aide de la technologie des microbilles, ce qui permet une expansion ultérieure des lymphocytes T γδ avec des APAC dérivés de K562.

Pour la validation du procédé, seulement 5 × ¹⁰⁶ lymphocytes T γδ expansés par l’acide zolédronique ont été utilisés pour l’expansion de la co-culture de phase 2 avec les aPAC. Dans cette deuxième phase d’expansion, les lymphocytes T γδ sont activés à l’aide d’une banque de cellules de travail (BOC) conforme aux bonnes pratiques de fabrication (CGF) actuellement conforme aux BPC dérivés de K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fabriquée à Moffitt. La raison d’être de cette expansion biphasique est basée sur la capacité de l’acide zolédronique à inhiber la farnésyl diphosphate synthase (FDPS) dans les monocytes, conduisant à l’accumulation de pyrophosphate d’isopentenyl, qui stimule directement les cellules Vγ2Vδ2. Dans la deuxième phase d’expansion, les APAC dérivés de K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fournissent une stimulation robuste à tous les lymphocytes T. Cependant, le produit cellulaire a déjà été enrichi pour les cellules T γδ, ce qui a entraîné une expansion robuste des cellules T γδ.

Avec l’utilisation d’équipements et de flacons spécifiques, le processus est un système fonctionnellement fermé, réduisant ainsi le risque de contamination. De plus, le bioréacteur à système fermé de 1 L facilite la croissance et l’expansion maximales des cellules dans un volume total de 1 L de milieu avec un besoin minimal d’alimentation. L’avantage de la méthode Moffitt est qu’elle fournit un système GMP rapide, reproductible et hautement réalisable pour produire un produit de cellules T γδ très pur, dérivé d’un donneur, pour une administration allogénique. Cette méthode peut être appliquée à tout essai clinique visant à utiliser des lymphocytes T γδ humains exprimant des récepteurs de lymphocytes T Vγ2Vδ2 comme immunothérapie adoptive pour médier l’immunité contre les microbes et les tumeurs chez les patients cancéreux présentant une rémission partielle et complète. En outre, il fournit une plate-forme robuste pour le développement et la production de cellules T à récepteur d’antigène chimérique γδ positif (CAR⁺).

Protocol

REMARQUE : L’approbation de la CISR a été obtenue et le consentement éclairé des donateurs a été obtenu. 1. Isolement lymphocytaire Transférez le produit d’aphérèse dans une salle blanche.REMARQUE: La validation du processus a été effectuée à l’aide de l’aphérèse normale d’un donneur d’un fournisseur commercial externe conforme aux réglementations de collecte des matières premières cellulaires. Prélever des échantillons pour les tests de stérilité, le nombre de cellules et le phénotypage cellulaire. Elutrier sur le dispositif de centrifugation à contre-courant à l’aide d’un milieu primaire de la solution saline équilibrée de Hanks avec de l’albumine sérique humaine (HSA) à 1 % et un milieu secondaire de solution saline (injection de chlorure de sodium USP à 0,9 %) ou de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco. Réglez la vitesse de centrifugation d’élutriation à 900 × g et collectez les fractions en fonction du débit et du temps. Prélever des échantillons de la fraction 2 et effectuer les essais suivants: 2 mL pour les tests de stérilité; 0,5 mL pour le nombre de cellules et la viabilité à l’aide d’acridine orange/iodure de propidium (AO/PI); 5 × 106 cellules pour le phénotypage cellulaire par cytométrie en flux. Développer une fraction lymphocytaire pure (fraction 2) de cellules en culture à 10 × 106 cellules/cm2 dans un bioréacteur à système fermé de 1 L avec 5 μmol/L d’acide zolédronique et 300 UI/mL d’IL-2. Incuber pendant sept jours dans un incubateur fixé à 37 °C avec 5% de CO2. 2. Épuisement des lymphocytes T alpha-bêta (αβ) Récoltez des cellules dans la fiole de bioréacteur à système fermé de 1 L. Soudez stérilement un pack de transfert de 1 L sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé et utilisez la pompe pharmaceutique appropriée pour transférer les cellules dans le pack de transfert. Prélever les échantillons suivants : 10 mL pour la stérilité moyenne usée; 0,5 mL de cellules pour le nombre de cellules et la viabilité à l’aide de l’AO/PI; 5 × 106 cellules pour la cytométrie en flux Remettre en suspension les cellules à ~5 × 108 cellules/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un tampon (PBS/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) + 0,5 % HSA et anticorps spécifique tCR αβ biotinylé. Placez le shaker au réfrigérateur et incubez les cellules à 2-8 °C pendant environ 15 min en agitant. Lavez les cellules avec un total de 600 mL de tampon PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrifuger pour éliminer l’anticorps non lié à 200-500 × g pendant 15 min à 2-8 °C. Remettre en suspension ~5 × 108 cellules/mL dans un tampon PBS/EDTA + 0,5 % HSA avec des microbilles spécifiques à l’antibiotine (flacon de 7,5 mL/1). Placez le shaker au réfrigérateur et incubez les cellules à 2-8 °C pendant environ 15 min en agitant. Après incubation, centrifuger les cellules à 200-500 × g pendant 15 min à 2-8 °C pour éliminer les microbilles non liées. Remettez en suspension ~ 6 × 107 cellules / mL dans un tampon PBS / EDTA + 0,5% HSA et transférez-les dans un sac de transfert. Installez l’ensemble de tubes dans le dispositif de séparation des cellules magnétiques de qualité clinique en suivant les instructions du fabricant, placez les emballages avec le tampon PBS/EDTA et le pack de transfert avec le produit cellulaire dans l’instrument et piquez-le lorsque l’instrument l’indique. Sélectionnez le protocole Depletion 1.2 pour l’épuisement des lymphocytes T αβ marqués. Centrifuger la fraction cible (lymphocytes T γδ enrichis) et remettre en suspension les cellules dans un milieu complété par 10% de sérum AB humain. Prélever un échantillon de 0,5 mL et effectuer un comptage cellulaire et une viabilité avec une coloration AO/PI. Amener les cellules à une concentration finale d’environ 1 × 106 cellules/mL. Prélever un échantillon de 5 × 106 cellules du produit pour le phénotypage de cytométrie en flux après épuisement. 3. Co-culture avec les APC Irradier 5 × 107 aPAC/flacon à 100 Gy sur l’instrument générateur de rayons X. Utilisez les aPAC en co-culture dans un rapport de 10:1 avec les lymphocytes T γδ. Placer les APAC irradiés (5 × 107 cellules/fiole) et les lymphocytes T γδ (5 × 106 cellules/fiole) dans des flacons de bioréacteur à système fermé de 1 L avec 1 L de milieu de culture complété par 10 % de sérum AB humain. Ensemencez jusqu’à 10 flacons. Dilatez les cellules en culture pendant 10 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Surveillez les niveaux de glucose et de lactate tous les 3-4 jours à l’aide de bandelettes, de glucose et d’un compteur de lactate. Si le glucose tombe à 250 mg/dL, réduire le volume dans la fiole à 200 mL à l’aide d’une pompe pharmaceutique en soudant stérilement un pack de transfert de 1 L sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé. Mélanger les cellules dans les 200 mL restants et prélever un échantillon de 0,5 mL pour le comptage cellulaire et la mesure de la viabilité par coloration AO-PI. Si le nombre de cellules est ≥109, divisez une fiole en deux fioles et remplissez chaque fiole jusqu’à 1 L avec AIM-V complété par 10% de sérum AB humain. Si le nombre de cellules est <109, nourrissez les cellules avec un litre frais de milieu de culture complété par 10% de sérum AB humain. Répétez l’étape 3.6 pour toutes les fioles et retournez-les à l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Répétez les étapes 3.4 à 3.7 tous les 3 à 4 jours. 4. Récolte cellulaire Au bout de 10 jours en co-culture, récoltez toutes les fioles du bioréacteur. Récoltez 1 flacon de bioréacteur à la fois et regroupez toutes les cellules dans un paquet de transfert de taille appropriée. Soudez stérilement le pack de transfert sur la ligne rouge du bioréacteur à système fermé et utilisez la pompe pharmaceutique pour transférer les cellules dans le pack de transfert. Prélever les échantillons de contrôle de la qualité suivants : 1 % du produit pharmaceutique (DP) pour la stérilité par hémoculture et coloration au gramme; 0,5 mL pour le comptage cellulaire et la viabilité à l’aide de l’AO/PI; 5 à 10 × 106 cellules pour la cytométrie en flux (voir la figure 1 pour la stratégie de contrôle); 0,5 mL pour l’endotoxine; 0,5 mL pour la coloration au gramme; 106 cellules ont atteint 10 mL de milieu usé pour le test des mycoplasmes. Centrifuger les cellules à 200-500 × g pendant 15 min à température ambiante et jeter le surnageant. Laver les cellules dans une solution de solution cristalloïde équilibrée + 0,5% HSA à 200-500 × g pendant 15 min à température ambiante. Remettez-les en suspension dans un volume cible de 100-300 mL de solution cristalloïde équilibrée + 0,5% de HSA. 5. Tests de libération Effectuer des tests de contrôle de la qualité de la cellule T γδ DP pour les éléments suivants: pureté et identité par cytométrie en flux (vivants / morts, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); viabilité par coloration AO/PI; endotoxine; Test des mycoplasmes par réaction en chaîne par polymérase (PCR); stérilité par coloration de Gramme et hémocultures aérobies et anaérobies; test K562 résiduel par cytométrie en flux (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

Le processus des lymphocytes T γδ a été caractérisé et optimisé pour la production du produit médicamenteux à base de lymphocytes T γδ. L’optimisation du processus comprenait 1) l’enrichissement des lymphocytes par élutriation, 2) l’expansion spécifique des cellules cellulaires γδ T (DS) avec de l’acide zolédronique, 3) l’épuisement du TCRαβ par les cellules T γδ, 4) l’expansion secondaire de la cellule T γδ DS à l’aide d’APC dérivés de K562, et 5) la récolte finale de DP et la formulation du produit pour administration ou cryoconservation. Après l’optimisation du processus, des cycles de confirmation ont été effectués à grande échelle en utilisant le matériel dérivé de trois donneurs sains pour confirmer l’adéquation du traitement cellulaire. Toutes les données ont été analysées et sont résumées dans les tableaux 1, 2 et 3. Les cellules séparées de la fraction 2 (F2) de centrifugation post-contre-courant ont donné une population de lymphocytes purs avec une moyenne de 99,23 % de cellules CD45+ (rapportées comme la fréquence de la porte vivante totale) et une excellente viabilité moyenne de 95,80 % (tableau 1). L’expansion spécifique des lymphocytes T γδ avec l’acide zolédronique dépendait du pourcentage initial de cellules tueuses naturelles (NK) présentes dans la fraction lymphocytaire (F2) après élution. L’enrichissement des lymphocytes T γδ DS avec épuisement TCRαβ était cohérent (tableau 2). Le DP des lymphocytes T γδ fabriqué à partir de trois donneurs sains avait en moyenne 0,11 % ± 0,05 % de lymphocytes B CD20+ et 0,00 % ± 0,00 % de lymphocytes TCR αβ+, répondant ainsi au critère de libération de ≤1 % des lymphocytes T TCR αβ+. Le pourcentage moyen de cellules NK dans le produit final est de 17,06% ± 26,19% et répond au critère de libération de <35%. De plus, le pourcentage moyen de cellules négatives de lymphocytes T et de cellules de lignée NK dans le produit final était de 0,48 % ± de 0,42 % (tableau 3). La coloration de la surface cellulaire et l’analyse cytométrique en flux ont été utilisées pour caractériser l’identité, la pureté et les impuretés de processus du DS et du DP, comme le montre la figure 2A-D. L’expansion secondaire, obtenue à partir de la co-culture de l’aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB et de la cellule T γδ DS à un rapport de 10:1, a généré une DP de cellule T γδ qui répondait à tous les critères de libération, comme le montre le tableau 4. En outre, les cellules ont été colorées et évaluées par cytométrie en flux au jour 0-centrifugation à contre-courant F2 cellules, jour 7-cellules T dilatées par l’acide zolédronique, jour 7-TCR épuisement des cellules T αβ, jour 17-final DP pour le groupe de biomarqueurs de différenciation (CD)3 suivant, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC chemokine receptor 7 (CCR7), programmable cell death protein-1 (PD-1), la protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (CTLA4), le gène 3 activant les lymphocytes (LAG3) et la protéine 3 contenant les immunoglobulines et les mucines des lymphocytes T (TIM3). Les données présentées à la figure 3 sont calculées en moyenne à partir de trois séries indépendantes et démontrent que les cellules n’ont pas atteint l’épuisement. Le CTF Moffitt a également mis au point un test K562 résiduel pour déterminer les impuretés DP liées aux APAC dérivés de K562 (Figure 4). La stratégie de contrôle cytométrique en flux utilisée pour caractériser les pourcentages des types de cellules était la suivante : 1) contrôle sur la population négative de lignée cellulaire T et NK (CD3-CD56-CD16-); 2) porte sur CD71+ (récepteur de la transferrine exprimé en lignée érythroïde et LAM permettant la détection des cellules K562 résiduelles). Cette stratégie de contrôle a permis d’évaluer les cellules CD3-CD16-CD56-CD71+, qui sont les WCB aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) (appelé « K562 résiduel » à la figure 4). Ce contrôle permet le dénombrement du K562 résiduel dans le PDD final en multipliant la fréquence du K562 résiduel par le nombre total viable (TVC) du DP (71+ × DP TVC = Cellules K562 résiduelles dans le PDD). Toutes les données cytométriques en flux sont rapportées comme la fréquence des cellules vivantes. Le tableau 5 et la figure 4 présentent les pourcentages de cellules T et de lignées cellulaires NK négatives ainsi que de cellules K562 résiduelles. Un test t à deux queues a été effectué pour déterminer la signification statistique des différences entre ces populations et a révélé qu’il y avait une différence significative entre le DP des lymphocytes T WCB et γδ et entre les lymphocytes T WCB et γδ (t = 0,0019 pour les lymphocytes T et la lignée cellulaire NK négative; t < 0,0001 pour K562 résiduel et t = 0,0314 pour les lymphocytes T et les cellules NK à la lignée négative; t < 0,0001 pour le K562 résiduel) (tableau 5). Figure 1 : Représentation schématique de la stratégie de contrôle cytométrique en flux. Abréviations: aAPC = , cellule présentant l’antigène artificiel; SSC-A = zone de dispersion latérale du pic; FSC-A = zone de dispersion vers l’avant du pic; SSC-H = hauteur de dispersion latérale du pic; FSC-H = hauteur de dispersion vers l’avant du pic; CD = groupe de différenciation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Composition de la matière première, des produits intermédiaires et du produit pharmaceutique final. Toutes les données présentées sont calculées en moyenne à partir de trois séries indépendantes. (A) L’aphérèse de donneurs sains subit une élutriation à l’aide du dispositif de centrifugation à contre-courant, ce qui donne F2 (fraction riche en lymphocytes), qui est utilisée comme matière première. (B) F2 subit une expansion spécifique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 pendant 7 jours avec 5 μmol/L d’acide zolédronique et 300 UI/mL d’IL-2 dans 1 L de milieu complété par 10 % de sérum AB humain. (C) L’épuisement des lymphocytes T TCR αβ est effectué sur le produit expansé par l’acide zolédronique. (D) Un médicament à base de lymphocytes T γδ très pur est récolté après une deuxième expansion de 10 jours avec des APAC irradiés dans un rapport de 1:10 avec 5 μmol/L d’acide zolédronique et 300 UI/mL d’IL-2 dans 1 L de milieu complété par du sérum AB humain à 10 %. Abréviations: NK = tueur naturel; CD = groupe de différenciation; TCR= récepteur des lymphocytes T; IL = interleukine; aPAC = cellules artificielles présentatrices d’antigènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Biomarqueurs du matériel de départ, des produits intermédiaires et du produit pharmaceutique final. Les cellules sont collectées et colorées pour CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 et TIM3 aux cellules F2 de centrifugation à contre-courant de jour 0, aux cellules T expansées par l’acide zolédronique de jour 7, à l’épuisement des cellules T αβ du jour 7-TCR, au produit pharmaceutique final du jour 17. Toutes les données présentées sont calculées en moyenne à partir de trois séries indépendantes. (A) Souches (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- et CCR7+) représentées en nombre total de cellules vivantes. (B) Mémoire centrale (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ et CCR7+) représentée en pourcentage des cellules CD3+ TCR γδ+. Abréviations : CD = cluster de différenciation ; TCR= récepteur des lymphocytes T; IL = interleukine; . CCR7 = RÉCEPTEUR CC chimiokine 7; PD-1 = protéine de mort cellulaire programmée-1; CTLA4 = cytotoxique protéine 4 associée aux lymphocytes T; LAG3 = gène 3 activant les lymphocytes; TIM3 = immunoglobuline des lymphocytes T et protéine 3 contenant le domaine de la mucine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Données représentatives d’un essai résiduel K562 (CD3-CD16-CD56-CD71+). Abréviations : aAPC = cellule artificielle présentatrice d’antigènes; NK = cellule tueuse naturelle; SSC-A = zone de dispersion latérale du pic; CD = groupe de différenciation; IL = interleukine; TCR = récepteur des lymphocytes T; MCB = banque de cellules maîtresses ; FMO = fluorescence moins un; DP = produit pharmaceutique; CAT = banque de cellules de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Étapes du processus Paramètres Donateurs Moyenne St. Dev. Exécution 1 Exécution 2 Exécution 3 Post-enrichissement (fraction lymphocytaire F2) TVC Toutes les validations de processus ont été ensemencées à 109 TVC 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 0.00 Viabilité (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 Lymphocytes B CD20+ (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 Lymphocytes T CD3+ (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 Cellules CD3-CD56+CD16+ NK (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 Lignée de cellules T et NK négative (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tableau 1 : Résumé de l’enrichissement des lymphocytes par élutriation rapporté comme fréquence des cellules vivantes. Abréviations : TVC = nombre total viable; TCR = récepteur des lymphocytes T; CD = groupe de différenciation; NK = cellule tueuse naturelle. Étapes du processus Paramètres Donateurs Moyenne St. Dev. Exécution 1 Exécution 2 Exécution 3 Expansion post-acide zolédronique de 7 jours (épuisement pré-TCRαβ) TvC 3,69 X 109 1,79 X 109 1,42 X 109 2,3 X 109 1,22 X 109 Viabilité (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 Cellules B CD20+ 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 Lymphocytes T CD3+ (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 Cellules CD3-CD56+CD16+ NK (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 Lignée de cellules T et NK négative (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Épuisement post-TCRαβ TvC 1,81 x 109 4,95 X 108 3,80 X 108 8,95 X108 7,94 X 108 Viabilité cellulaire (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 Cellules B CD20+ 2.26 12 6.59 6.95 4.88 Lymphocytes T CD3+ (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 Cellules CD3-CD56+CD16+ NK (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 Lignée de cellules T et NK négative (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4,95 x 103 3,8 X 103 2,92 X 103 2,59 X 103 TCR γδ+ TVC 1,73 X 109 2,23 X 108 3,39 X 108 7,64 X 108 8,39 X 108 CD3-CD56+CD16+ NK TVC 6,97 X 107 2,97 X 108 3.72E+07 1,35 X 108 1,42 X 108 Tableau 2 : Résumé de l’expansion des lymphocytes T γδ avec de l’acide zolédronique et de l’enrichissement des instruments rapportés comme fréquence des cellules vivantes. Abréviations:TVC = nombre total viable; TCR = récepteur des lymphocytes T; CD = groupe de différenciation; NK = cellule tueuse naturelle. Attributs du produit Paramètres Donateurs Moyenne St. Dev. Exécution 1 Exécution 2 Exécution 3 Jour 0 γδ Lymphocytes T 2,48 X 107 1,59 X 107 2,10 X 107 2,06 X 107 4,47 X 107 Jour 7 après l’enrichissement des lymphocytes T γδ 1,73 X 109 2,23 X 108 3,39 X 108 7,64 X 108 8,39 X 108 Expansion du pli au jour 7 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC à la récolte* 8,14 X 1010 1,67 X 1010 6,84 X 1010 5,55 X 1010 3,42 X 1010 Viabilité cellulaire (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 Lymphocytes B CD20+ (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 Lymphocytes T CD3+ (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 Cellules CD3-CD56+CD16+ NK (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 Lymphocytes T et lignée cellulaire NK négatifs, CD71+ Résidu k562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Nombre total de lymphocytes T γδ à la récolte 7,93 X 1012 8,38 X 1011 6,65 X 1012 5,14 X 1012 3,78 X 1012 Expansion totale du pli des lymphocytes T γδ (du jour 0 à la récolte) 3,20 X 105 5,27 X 104 3,17 X 105 2,30 X 105 1,53 X 105 *La validation du procédé a été réduite à une fiole avec 5 cellules T γδ 106 et 50 APC irradiés X106. Les chiffres déclarés concernent une projection à grande échelle si 24 flacons sont ensemencés à partir de la substance médicamenteuse D7 utilisée. Tableau 3 : Résumé de la co-culture de lymphocytes T γδ+ avec des PAC et de la récolte élargie de lymphocytes T γδ+ rapportés comme fréquence des cellules vivantes. *La validation du procédé a été réduite à un bioréacteur à système fermé (capacité de 1 L) avec 5 × 106 lymphocytes T γδ et 50 × 106 aPAC irradiés. Les chiffres déclarés concernent une projection à grande échelle si 24 flacons sont ensemencés à partir de la substance médicamenteuse D7. Abréviations : aPAC = cellules artificielles présentatrices d’antigènes; TVC = nombre total viable; TCR = récepteur des lymphocytes T; CD = groupe de différenciation; NK = cellule tueuse naturelle. Paramètre de test Critères d’acceptation Résultats Validation 1 Validation 2 Validation 3 Viabilité ≥ 70 % 92.80% 85.50% 87.30% Mycoplasma Négatif Négatif Négatif Négatif Stérilité Pas de croissance finale (14 jours) Pas de croissance finale (14 jours) Pas de croissance finale (14 jours) Pas de croissance finale (14 jours) Tache de Gram Aucun organisme vu (NOS) Nos Nos Nos Endotoxine ≤ 2 UE/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL Tableau 4 : Résumé des résultats des essais de libération du contrôle de la qualité pour les lymphocytes T γδ. Dosage résiduel K562 K562 Cat γδ seulement γδ + Produit WCB Lignée cellulaire T et NK neg. % K562 % résiduel Lignée cellulaire T et NK neg. % K562 % résiduel Lignée cellulaire T et NK neg. % K562 % résiduel Lignée cellulaire T et NK neg. % K562 % résiduel 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 N/A N/A 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 N/A N/A N/A N/A 98.7 98.3 98.6 97.6 N/A N/A N/A N/A Moyenne 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 St. Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tableau 5 : Pourcentages K562 négatifs et résiduels de lignée t et de cellules NK déclarés comme fréquence des cellules vivantes. Abréviations: NK = cellule tueuse naturelle; CAT = banque de cellules de travail.

Discussion

Le laboratoire de thérapie cellulaire Moffit a développé un protocole avec une expansion biphasique de cellules T γδ très pures pour une utilisation en tant que DP dans les essais cliniques. Ce protocole fournit une méthode de fabrication selon les directives cGMP dans un système fermé qui donne un DP de cellule T γδ très pur qui est activé et étendu avec succès par l’acide zolédronique et les aPAC WCB. Ce protocole a été approuvé par la FDA pour la fabrication d’un DP allogénique à cellules T γδ pour les patients atteints de LAM. En utilisant des donneurs sains, nous avons réussi à augmenter la petite population de lymphocytes T γδ donneurs en seulement 7 jours de 2,06 ± 0,45% à 54,45 ± 28,34%. Après l’expansion de 7 jours avec l’acide zolédronique, il a été observé que le donneur 2 avait une augmentation de la population de NK.

L’acide zolédronique inhibe la farnésyl diphosphate synthase (FDPS) dans les monocytes, ce qui, à son tour, conduit à l’accumulation de pyrophosphate d’isopentenyl (IPP), qui a été corrélée à une augmentation significative de la prolifération des cellules T et des cellules NK ^{naturelles7,8,9}. Cette augmentation de la population de NK entrave la ^2ème phase d’expansion avec les APAC, car les APAC ne feront que contribuer à l’expansion ultérieure des cellules NK. Pour cette raison, les critères des donneurs ont été modifiés pour exclure les donneurs ayant des populations élevées de NK. Après épuisement des lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ ont été enrichis à 76,61 ± 27,51 %. Ce protocole unique comprend une deuxième expansion utilisant les APAC fabriqués par Moffit pour cibler les récepteurs CD8, CD28 et CD127L dans les cellules T γδ. Cette deuxième phase d’expansion avec les APAC a donné un DP avec ≥65% pour les cellules T CD3⁺TCR γδ⁺, ≤1% TCRαβ T et <35% ^cd3-CD16+CD56⁺ NK. En raison de l’utilisation d’APC dérivés du K562, il était nécessaire de démontrer que ces APAC représentaient <1 % du produit final.

Le CTF Moffit a mis au point un test cytométrique en flux utilisé pour les critères de libération afin de mesurer le pourcentage de cellules K562 résiduelles dans le DP final. Ce test cytométrique en flux atténue tous les problèmes liés à l’utilisation d’antigènes de surface cellulaire pour identifier les cellules K562. Comme les lymphocytes T activés peuvent exprimer CD71, nous avons conçu une stratégie pour exclure tous les lymphocytes T et les cellules NK en examinant les populations ^CD3-CD56– et CD16^–, puis en examinant les cellules CD71⁺, qui seraient exclusivement des cellules K562. Ce protocole démontre que le DP des lymphocytes T γδ produit 0,48 ± 0,42% des cellules K562 résiduelles et répond à tous les critères de libération de ≥70% de viabilité, de négativité de Mycoplasma par PCR, d’absence d’organismes vus par coloration au gramme, de ≤2 EU/mL d’endotoxine et d’absence de stérilité d’hémoculture finale de croissance (14 jours).

Materials

Hanks Balanced Salt Solution	R&D	285-GMP
Human Albumin 25%	Grifolis	65483-16-071
Plasmalyte A	Fisher	2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa)	Hos pira	4215-04–8	FDA approved drug
DMSO	WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH	WAK-DMSO-10
CS10	BIOLIFE SOLUTIONS	210374
3 mL syringe	BD	309657
10 mL syringe	BD	309604
20 mL syringe	BD	302830
50 mL syringe	BD	309653
100 mL syringe	JMS	992861
18g Needle	Fisher	305198
Cryovials 1.8 mL	Fisher	375418
5 mL pipette	Fisher	1367811D
50 mL pipette	Fisher	1367610Q
10 mL pipette	Fisher	1367811E
100 mL pipette	Fisher	07-200-620
15 mL conical	Fisher	05-539-12
50 mL conical	Fisher	05-539-7
250 mL conical	Fisher	430776
600 mL Transfer Pack	TERUMO BCT INC	1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set	INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES	03-220-90
Elutra Tubing Set	TerumoBCT	70800
100 MCS GREX	WILSON WOLF MFG CORP	81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system	Fisher Scientific	22-246660
Acacia Pump boot	MPS Medical In	17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec Inc	130-070-525
Dornase Alpha	Genentech, Inc	50242-100-40/186-0055	FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter	Fisher	157-0020
Blood Filter 170um	B.Braun	V2500
CliniMACs Tubing set	Miltenyi Biotec Inc	130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit	Miltenyi Biotec Inc	130-021-301
Y-Type blood set	Fenwal	FWL4C2498H
75 mL Flask	Fisher	430641U
IL-2	Prometheus	65483-116-071	FDA approved drug
AIM-V	Fisher	0870112BK
Human AB serum	Gemini Bio-Product	100H41T
3 Liter Transfer pack	Independent Medical Associates	T3109
1000  pipette tips	Fisher Scientific	5991040
CF-250	KOLBio	CF-250
Elutra	TERUMOBCT
CliniMACS	Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump	WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator	Thermo Scientific