En automatiseret mikroskopisk scoringsmetode til γ-H2AX Foci-analysen i humane perifere blodlymfocytter

Summary

Denne protokol præsenterer dias forberedelse og automatiseret scoring af γ-H2AX foci assay på perifere blod lymfocytter. For at illustrere analysens metode og følsomhed blev isolerede lymfocytter bestrålet in vitro. Denne automatiserede metode til DNA DSB-detektion er nyttig til hurtige og højgennemsigtede biologiske dosimetryapplikationer.

Abstract

Irerende stråling er en potent inducer af DNA-skader og et veldokumenteret kræftfremkaldende stof. Biologisk dosimetri omfatter påvisning af biologiske virkninger forårsaget af udsættelse for istidsstråling for at foretage en individuel dosisvurdering. Dette er relevant i forbindelse med strålingskriser, hvor sundhedsvurderinger og planlægning af klinisk behandling af udsatte ofre er afgørende. Da DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB) anses for at være den mest dødelige form for strålingsinduceret DNA-skade, præsenterer denne protokol en metode til at detektere DNA DSB i blodprøver. Metoden er baseret på påvisning af et fluorescerende mærket fosforyleret DNA-reparationsprotein, nemlig γ-H2AX. Brugen af en automatiseret mikroskopiplatform til at score antallet af γ-H2AX foci pr. celle giver mulighed for en standardiseret analyse med et betydeligt fald i turn-around-tiden. Derfor har γ-H2AX-analysen potentiale til at blive en af de hurtigste og følsomme analyser for biologisk dosimetri. I denne protokol vil hele blodprøver fra raske voksne frivillige blive behandlet og bestrålet in vitro for at illustrere brugen af den automatiserede og følsomme γ-H2AX foci assay til biodosimetry applikationer. Der anvendes et automatiseret slidescanningssystem og analyseplatform med et integreret fluorescensmikroskop, som muliggør hurtig, automatisk scoring af DNA DSB med en reduceret grad af bias.

Introduction

Siden opdagelsen er idriftiserende stråling (IR) blevet et uundværligt redskab i den nuværende medicinske og industrielle praksis samt i landbrugs- og militærapplikationer. Den brede anvendelse af IR øger imidlertid også risikoen for overeksponering for stråling for både professionelle strålingsarbejdere og medlemmer af offentligheden. IR er et velkendt fysisk kræftfremkaldende stof, der kan fremkalde DNA-skader på en direkte eller indirekte måde, hvilket fører til betydelige sundhedsrisici ^1,2. Derfor er det vigtigt at udføre en dosisvurdering, da eksponeringsgraden udgør et vigtigt indledende skridt i forvaltningen af strålingsulykken ¹.

I tilfælde af store nukleare eller radiologiske nødsituationer kan antallet af dosisvurderinger, der skal udføres, variere fra nogle få til tusinder af mennesker afhængigt af ulykkens størrelse³. I disse scenarier kan fysisk dosimetry også være tvetydig (f.eks. hvis dosimeteret ikke bæres korrekt) eller ikke er tilgængeligt, når medlemmer af offentligheden er involveret. Mens kliniske symptomer kan bruges til triage, de er ikke nødvendigvis stråling specifikke og kan resultere i en falsk diagnose. Derfor er det tilrådeligt at bruge biologisk dosimetry sammen med fysisk dosimetry og kliniske vurderinger. Denne metode gør det muligt at analysere strålingsinducerede ændringer på celleniveau og muliggør utvetydig identifikation af udsatte personer, der kræver medicinsk behandling⁴. Lægen kan derefter bruge denne biologiske dosis vurdering til at supplere fysiske dosis rekonstruktioner og andre kliniske diagnoser, for at ordinere den relevante lægehjælp⁵. Behovet for biologisk dosimetry vil være særligt højt for triage og medicinsk håndtering af tab, når eksponeringsscenariet ikke er velkendt, og når ofrene er medlemmer af offentligheden. Hovedformålet med triage er effektivt at skelne “bekymrede godt” personer, der kunne have prodromale symptomer, men som ikke fik en høj dosis, fra udsatte personer, der har brug for øjeblikkelig lægehjælp og specialiseret pleje. Tærskelniveauet for strålingsdosis, der kan forårsage strålesyge, er ca. 0,75 – 1,00 Gy. Derefter har de personer, der modtager > 2 Gy eksponering, en højere risiko for akut strålingssyndrom og bør modtage hurtig medicinsk behandling^6,7. Rettidige og nøjagtige biologiske dosisestimater for ofre, der er fanget i krydsilden af sådanne katastrofer, er kritiske. Derudover kan det også trøste og berolige minimalt udsatte ofre⁸.

Strålingsbeskyttelsesmyndigheder bruger forskellige biodosimetrymarkører, som hovedsagelig er baseret på påvisning af cytogenetiske skader, såsom dicentriske kromosomer eller mikrokerner, i dyrkede menneskelige lymfocytter⁹. Påvisning af cytogenetiske skader kan også udføres ved fluorescerende in situ hybridisering (FISH) translokation assay¹⁰. Den største ulempe ved de konventionelle cytogenetiske metoder er imidlertid den lange ekspeditionstid for at opnå resultaterne i en nødsituation⁸.

Et af de tidligste trin i DNA DSB’s anerkendelsesproces er fosforyleringen af histonevarianten H2AX, der fører til dannelse af γ-H2AX og efterfølgende rekruttering af reparationsfaktorer. I løbet af det seneste årti har påvisning af strålingsinduceret γ-H2AX foci i perifere blodlymfocytter ved hjælp af immunofluorescencemikroskopi fået stigende opmærksomhed som et pålideligt biologisk dosimetryværktøj^{11,12,13,14,15}. Afhængigt af strålingskvaliteten og celletypen det maksimale udbytte af γ-H2AX foci detekteres inden for 0,5 – 1 time efter bestråling^16,17. Det forventes, at der er en tæt sammenhæng mellem antallet af DNA DSB og γ-H2AX foci, samt mellem forsvinden af foci og DSB reparation. Laser saks eksperimenter med en pulserende laser mikrostråle har vist, at γ-H2AX foci lokalisere til de steder af DNA DSB¹⁸. Selv om det fortsat er et emne for aktiv debat, en af de tidligste undersøgelser med ¹²⁵jeg foreslog en en-til-en sammenhæng mellem det beregnede antal opløsninger pr celle (kan repræsenteres for antallet af stråling-induceret DNA DSB) og antallet af γ-H2AX foci, der blev scoret^19,20.

I løbet af det seneste årti har EU finansieret MULTIBIODOSE-projekterne (tværfaglige biodosimetricværktøjer til håndtering af radiologiske tab i stor skala) og RENEB (realisering af det europæiske netværk af biodosimetry) for at skabe et bæredygtigt netværk inden for biologisk og retrospektivt dosimetry^21,22. Dette projekt omfattede forskellige laboratorier i hele Europa til at evaluere beredskabskapaciteten i tilfælde af en radiologisk nødsituation^14,21,22. Den γ-H2AX foci-analyse har en række betydelige fordele, såsom en hurtig behandlingstid, potentialet for batchbehandling, der giver mulighed for høj gennemløb, samt dens høje følsomhed, hvis den anvendes inden for få timer efter eksponering^13,23,24. Analysens høje følsomhed i lavdosisområdet resulterede i en række undersøgelser, hvor γ-H2AX foci-analysen blev anvendt som indikator for effekten af medicinsk strålingseksponering, både i strålebehandling og i diagnostiske billeddannelsesapplikationer^{25,26,27,28,29,30}. Disse egenskaber gør γ-H2AX foci assay et meget konkurrencedygtigt alternativ til andre metoder til tidlig triage i store nukleare ulykker for at adskille kritisk eksponeret fra lav risiko enkeltpersoner. Flere optimeringseksperimenter har illustreret, at det er muligt at udføre γ-H2AX foci-analysen med små mængder blod, såsom undersøgelsen af Moquet et al., der rapporterede, at det er muligt at udføre γ-H2AX foci-analysen med kun en dråbe blod (fingerspids)³¹. En lignende tilgang blev anvendt i udviklingen af det fuldautomatiske RABIT-system (Rapid Automated Biodosimetry Tool), som blev optimeret til at måle γ-H2AX-udbytter fra fingerstick-afledte prøver af blod^32,33. Samlet set tyder resultaterne af multibiodose- og RENEB-intersammenligningsundersøgelserne på, at γ-H2AX foci-analysen kan være et meget nyttigt triageværktøj efter en nylig (op til 24 timers) akut strålingseksponering^12,13,14. I en intersammenligningsundersøgelse med lavt dosisinterval kunne der skelnes mellem en dosis helt ned til 10 mGy fra de falske bestrålede kontrolprøver, hvilket fremhævede analysens følsomhed i lavdosisområdet³⁴. Det er vigtigt at bemærke, at analysens høje følsomhed især gælder for lymfocytter, hvilket gør dem til en af de mest egnede celletyper til evaluering af eksponeringer med lav dosis. Lymfocytter er hovedsageligt ikke-cykling celler og repræsenterer en synkron befolkning. Sidstnævnte undgår udtryk for γ-H2AX er forbundet med DNA-replikation, hvilket reducerer analysens følsomhed over for detektering af strålingsinduceret DSB i G2- og S-fase af cellecyklussen betydeligt³⁵. Ud over dens følsomhed over for lave doser for lymfocytter er turnaround-tiden for γ-H2AX foci-analysen betydeligt hurtigere end cytogenetiske teknikker som den dicentriske og mikronukleusanalyse, da det ikke kræver stimulering af lymfocytter. Derfor kan resultater opnås inden for få timer sammenlignet med et par dage for cytogenetiske teknikker. En væsentlig ulempe ved analysen er den hurtige forsvinden af γ-H2AX foci signal, som normalt vil blive reduceret til baseline niveauer inden for få dage efter stråling eksponering afhængigt af DNA reparation kinetiker³⁶. Derfor er den mest egnede anvendelse af analysen i en biodosimetry sammenhæng til indledende triage formål og at prioritere mere tidskrævende cytogenetisk biologisk dosimetry opfølgning for visse ofre. For præcise retrospektive biodosimetry og langsigtede virkninger må man imidlertid stole på cytogenetiske teknikker såsom trefarvede FISH-analyser til påvisning af stabile kromosomafvigelser, hvis eksponeringen fandt sted for flere år siden.¹⁰.

Som en del af flere biodosimetry initiativer, flere analyser er blevet evalueret til triage formål ved siden af γ-H2AX foci assay til triage mennesker i store radiologiske nødsituationer; såsom dicentrics assay, cytokinsis-blok mikronukleus assay, elektron paramagnetisk resonans (EPR), serum protein assay (SPA), hud speckle assay (SSA), optisk stimuleret luminescens (OSL), samt genekspression analyse ^37,38. γ-H2AX foci-analysen kan anvendes kvantitativt til evaluering af DNA DSB-dannelse og reparation³⁹. Analysen er dog tidsafhængig, da niveauet for γ-H2AX foci varierer med tiden efter bestråling på grund af DNA DSB reparation kinetics⁴⁰. En sammenlignende undersøgelse viste, at mikroskopisk scoring med z-stage kapacitet giver de mest nøjagtige resultater efter 1 Gy af bestråling, mens flowcytometri kun giver pålidelige resultater ved højere doser af IR⁴¹. Der er mange rapporter om udviklingen af billedanalyseløsninger til brug i automatiseret scoring^{42,43,44,45,46}. I denne protokol, en automatiseret, high-throughput fluorescerende mikroskopi platform bruges til at analysere γ-H2AX foci i perifere blod lymfocytter. Brugen af et automatisk pointsystem undgår både inter-laboratorium og inter-observer scoring bias, mens det stadig giver tilstrækkelig følsomhed til at opdage doser under 1 Gy⁴⁷. Den primære fordel ved dette system i forhold til gratis open source-software til foci scoring er det faktum, at den komplette proces fra scanning af dias til at fange og score er automatiseret. Begrebet brugerdefinerbare og store klassificeringer garanterer reproducerbarhed, hvilket tilføjer en upartisk grad af kvalitet til resultaterne. Derfor illustrerer dette arbejde, hvordan γ-H2AX foci-resultater kan opnås ved hjælp af en automatiseret mikroskopisk scannings- og scoringsmetode, som kan bruges, når blodprøver fra potentielt overeksponerede personer modtages af radiobiologiske laboratorier til biologiske dosimetryformål.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af Biomedical Research Ethics Committee ved University of Western Cape Ethics Committee – Code BM18/6/12. 1. Udarbejdelse af løsninger48 Cellefikseringsløsning (3% PFA i PBS) Bær de relevante personlige værnemidler (PPE) og arbejder i en røghætte, tilsæt 20 g paraformaldehyd til 200 mL destilleret H2O. Varm blandingen op til 60 °C for at afhjælpe. Når PFA er opløst, tilsættes 40 dråber af 5 N NaOH forsigtigt over 30 minutter og afkøles til stuetemperatur. Juster til pH 7 ved hjælp af 1 M HCl og udgør op til et endeligt volumen på 250 mL med destilleret H2O (aliquots kan opbevares ved -20 °C i 1 år). Tilføj 25 mL fra denne løsning til 41,7 mL PBS for at få råd til en 3% PFA-løsning. 1% BSA (Bovine Serum Albumin) opløsning: Tilsæt 10 g BSA til 1000 mL PBS og bland indtil opløst. Opbevares ved 4 °C indtil brug (højst 72 timer). Triton-X Opløsning i koncentration på 1:500: Tilsættes 1 μL Triton-X til 500 μL PBS, opbevares ved 4 °C indtil brug (højst 24 timer). Antistofløsninger Primært antistof – Anti-γ-H2AX i koncentration af 1:500: Tilsættes 1 μL anti-γ-H2AX til 500 μL på 1% BSA-opløsning, opbevares ved 4 °C indtil brug (højst 24 timer). Sekundært antistof – DAM-TRITC i koncentration af 1:1000: Tilsættes 1 μL DAM-TRITC til 1000 μL på 1% BSA-opløsning, opbevares ved 4 °C indtil brug (højst 24 timer). Komplet Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Media Tilsæt filtreret Fosterkvægserum (FBS) og Penicillin-Streptomycin til RPMI 1640 medier i en steril flaske for at give en endelig koncentration på 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin. 2. Fremstilling af prøver BEMÆRK: Til denne protokol indsamles perifere hele blodprøver af venipuncture i lithium-heparin-opsamlingsrør fra raske voksne frivillige (med informeret samtykke – BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee under The University of Western Cape Ethics Committee). Før du begynder, skal du sørge for, at blodet og tætheden medium på 1.077 g/mL akklimatiseret til stuetemperatur. I et forberedt biosikkerhedskab fortyndes det perifere hele blod i et 1:1 volumen med PBS og lag forsigtigt det fortyndede blod på et tilsvarende volumen til to volumener medium med en densitet på 1,077 g / mL. Det er vigtigt gradvist at lægge blodet på tætheden medium ved at holde røret skrå ved 45 °, at sikre, at blod og tæthed medium ikke blandes. Overfør forsigtigt suspensionen til en centrifuge og drej ved 900 x g i 20 minutter. Derefter pipettes det ‘overskyede’ lag kun til et nyt sterilt konisk rør og fyldes røret med PBS og centrifuge i 10 minutter ved 1000 x g. Derefter aspirere supernatant med en pipette, være forsigtig med ikke at forstyrre pellet, genbruge PBMC pellet omhyggeligt i 1 mL PBS og fylde røret med PBS. Gentag ovenstående vasketrin to gange mere for at komme til i alt tre vaske. Tæl antallet af PBMCs ved hjælp af et hæmocytometer, klar over, at hver ML perifert blod fra en voksen donor vil resultere i et groft gennemsnit på 1 – 1,5 x 106 PBMCs49. Efter optælling fortyndes PBMC-pelleten til en koncentration på 8 x 105 lymfocytter i 1 mL cRPMI. Tilsæt derefter ca. 2 x 106 PBPC’er eller 2,5 mL fra den isolerede PBMC-opløsning til et sterilt, konisk rør til bestråling. 3. Bestråling af prøver FORSIGTIG: Håndter strålingsenheden i henhold til retningslinjer for strålingsbeskyttelse, og brug altid et fysisk dosimeter. Sørg for, at det anvendte bestrålingssystem er kalibreret og sat op, således at de korrekte forventede doser opnås. Irradiate PBMCs ved stuetemperatur ved hjælp af en 60Co kilde. Kalibrer (TRS-398 protokol) med en Farmer 117 kammer, for hvilket et kammer kalibrering faktor fra National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50. Til denne analyse placeres de koniske rør mellem et 5 mm akrylark (anvendes til opbygning af stråleindføring) og 50 mm backscatter-materiale med den nuværende 60Co-kildedosis på 0,57 Gy/min i en 300 mm × 300 mm homogen feltstørrelse ved 750 mm Kilde til overfladeafstand. Bestråle PBMCs med graduerede doser på 0,125, 0,500, 1.000, 1.500 og 2.000 Gy, og opretholde de falske bestrålede kontrolprøver, i kontrolrummet, modtager kun omgivende stråling eksponering. Inkuberes de bestrålede prøver i 1 time ved 37 °C i en befugtet 5% CO 2-inkubator for at nå det maksimale antal γ-H2AX foci.BEMÆRK: Inkubationstiden kan ændres i henhold til eksperimentelt design. 4. Slide forberedelse BEMÆRK: Se figur 1 for diasopsætning. Forbered 3 dias (tekniske gentagelser) ved hjælp af dias belagt med en positivt ladet overflade for at forbedre vedhæftning pr bestråling tilstand (eller per konisk rør). Placer diaset i klipholderen, tilføj filterkortet oven på det, og til sidst tragten. Fastgør glideclipsene, og placer dem i cytocentrifugen. Der tilsættes 250 μL af celleaffjedringen til tragten (200.000 celler/dias) og spinder i 30 x g i 5 minutter ved hjælp af en cytocentrifuge. Efter cytocentrifugering skal du fjerne diaset fra klippeholderen og bruge en hydrofob pen, tegne en cirkel rundt om stedet med cellerne for at bevare den immunofluorescent plet på de bundne celler under farvningsprocessen. 5. Fiksering og immunfluorescence γ-H2AX farvning BEMÆRK: Alle opløsninger tilsættes forsigtigt direkte på celleområdet, som er markeret med en hydrofob cirkel. Farvningsløsninger udleveres lidt over diaset uden at lade pipettespidsen forstyrre cellerne. Løsninger føjes IKKE til hele diaset. Fix dias i frisklavet 3% PFA i 20 minutter.BEMÆRK: Diasene kan opbevares i PBS, der indeholder 0,5 % PFA ved 4 °C i højst 2 dage, før immunstaining udføres. Derefter vaskes dias i en Coplin-krukke med PBS i 5 minutter, og dæk derefter cellerne med 100 μL af den kolde Triton-X-opløsning i 10 minutter for at tillade permeabilisering. Tip Triton-X-opløsningen af på silkepapir og vask diasene tre gange i 1% BSA-opløsning i 10 minutter. Dette gøres for at forhindre uønsket baggrund ved at blokere uspecifik antistofbinding. Inkuber dias ved stuetemperatur med 100 μL af det 1:500 fortyndede primære anti-γ-H2AX antistof i 1 time i et befugtningskammer, let udført ved at tilføje vådt silkepapir i bunden af en rektangulær slide opbevaringsboks. Tip antistofopløsningen af på silkepapir og udfør tre vaske med 1 % BSA-opløsning i 10 minutter i en Coplin-krukke for at fjerne ubundet primært antistof og for at forhindre ikke-specifik binding af det sekundære antistof. Inkuberes med 100 μL af den 1:1000 fortyndede sekundære DAM-TRITC antistofopløsning i 1 time i luftfugtningskammeret. Tip antistofopløsningen af på silkepapir og vask rutsjebanerne i PBS i 10 minutter tre gange. Tør endelig rutsjebanerne uden for den hydrofobiske cirkel med blødt, støvfrit silkepapir og tilsæt 1-2 dråber DAPI løst i et vandigt monteringsmedium og dæk forsigtigt diaset med et 24 x 50 mm dækselstræk, hvilket sikrer, at der ikke er fanget luftbobler og placeres i køleskabet ved 4 °C natten over. Slides kan opbevares ved 4 °C i højst 2 uger før scanning. 6. Automatiseret scanning og scoring af dias BEMÆRK: Scanningssystemet skal have et fluorescerende mikroskop, et CCD-kamera (opladet koblet enhed) i høj opløsning, der er tilsluttet en ramme grabber til realtids digitalisering af videobilleder, et scanningsstadium, trackball til manuelle bevægelser, 3D-mus, hurtig pc og skærm og harddisk til arkivering (Figur 2). Opsætning af klassificeringBEMÆRK: Klassificeringen er et sæt parametre, der definerer, hvordan systemet registrerer celler. Det er resultatet af uddannelsen baseret på præklassierede billedfelter. En klassificering er specifik for et mikroskop forstørrelse, celletype og laboratorium. Klassificeringer kan derfor kræve ændringer i følgende parametre for at tilpasse dem til de aktuelle forhold. Det anbefales at teste indstillingerne med et referencedias før evaluering. Billedopsamling: Brug et 40x tørt mål til billeddannelse. Hvis du vil opnå sammenlignelig billedkvalitet i alle celler, skal du indstille kameraets integrationstid til automatisk tilstand. Indstil den maksimale integrationstid til mindst 1 sekund for begge farvekanaler (kameraet får 4.0). Signalkanalen er anskaffet med 10 fokusfly og 14/40 μm mellem flyene. Cellevalg: Der registreres PBMCs inden for et interval på 20,00 μm2 og 76,00 μm2. Indstil den maksimale konkavitetsdybde til 0,05 og det maksimale højde-bredde-forhold til 1,4. Angiv den relative grænse for gråt niveau til 20 %. Cellebehandling: Behandl DAPI-tællerkanalen med en maksimal histogrammealgoritme for at reducere baggrunden. Signalkanalen behandles med et TopHat-filter (styrke 7, udjævningsfaktor 0) for at reducere baggrunden og for at forbedre signalerne. Signaltælling: Tæl foci ved hjælp af enhedens objektantal. For at undgå falsk-positiv evaluering af de resterende baggrundssignaler tælles kun de signaler, der viser mindst 30% af intensiteten sammenlignet med det lyseste objekt i cellen. Indsæt/Placer dias på den automatiserede scanningsplatform eller glidetrin, efter at være blevet forsigtigt rengjort med 70% ethanol, for at fjerne støv. Diasopsætning – dialogboksen Åbn diasopsætning (figur 3) Vælg den korrekte datasti, angiver dette, hvor de diasfiler, der er resultatet af søgningen, gemmes. Giv diaset et navn, hvert dias skal have et entydigt navn. Hvis der indtastes en række dias i form af en optalt liste, kan ‘?’ bruges som jokertegn for diasnummeret. Vælg den relevante klassificering som beskrevet i punkt 1.1 – 1.4 (Figur 4). Vælg søgevinduet, og vælg Foruddefineret, hvis der findes en søgevinduesdefinition, der svarer til cytocentrifugecellecirklen, vælg den respektive definition i kolonnen Størrelse, eller vælg Manuel, hvis der ikke er nogen foruddefineret definition af søgevindue. I dette tilfælde behøver kolonnen Størrelse ikke at blive angivet. Vælg Maksimalt antal celler, og tilføj det maksimale antal celler, der kræves for at blive scannet. Søgningen afsluttes, selvom det valgte søgevindue endnu ikke er blevet scannet helt, så snart Max Cell Count er nået. For biodosimetry applikationer, automatiseret scoring af 1000 celler pr dias er tilstrækkelig, i betragtning af at 3 dias pr blodprøve er udarbejdet. Klik på OK for at bekræfte indstillingerne. Installation af diasscanning Klik på knappen Søg på sidelinjen. Hvis indstillingen Manuel søgevindue blev valgt i diasopsætningen, åbnes der en dialog, der giver mulighed for bestemmelse af scanningsområdet (Figur 5). Hvis du bruger 10x-målsætningen, skal du vælge det rektangulære søgeområde på diaset interaktivt ved at fastgøre to hjørner af søgefeltet med venstre klik med musen. Dette kan bekræftes med knappen OK. Hvis søgevinduet refererer til et foruddefineret søgevindue, udelades dette trin. Brugeren bliver bedt om at justere en startposition for fokus. Et referenceobjekt vælges derefter automatisk, softwaren vil bede brugeren om at fokusere og centrere en referencekerne (ved hjælp af 40x-målsætningen) for hvert dias og bekræfte indstillinger med OK. Systemet flyttes automatisk til alle dias sekventielt. Hvis det er nødvendigt, skal du justere Opsætning af liveafbildning – Integrationstid for dette trin (Figur 5). Kontroller alle mikroskopindstillinger, og bekræft systemprompten med OK. Systemet starter den automatiserede fokus- og scanningsprocedure. Når scanningen er afsluttet, gemmes dataene på computeren til analyse. Scanningssystemet slukker automatisk, når scanningen er fuldført.BEMÆRK: Sørg for, at mikroskoprørets håndtag er i en position, der omdirigerer alt lys til kameraet. Søg End, søgningen afsluttes, hvis hele søgningen er blevet scannet, hvis det maksimale celleantal er nået, eller hvis søgningen er blevet annulleret. DiasanalyseBEMÆRK: Den færdige scanning er repræsenteret i figur 6. Når scanningen er fuldført, skal du klikke på knappen Galleri på sidelinjen. Gennemgå galleriet, som består af små billeder af fundne celler. I dette vindue (Figur 7) skal du angive, om de celler, der er gemt i galleriet efter et kriterium, der skal vælges i en rullemenu. Celler vises generelt i den rækkefølge, de er blevet registreret i. Klik på Kvalitets histogram/feature value diagram ( Figur8) for at give fordelingen af kvalitetsmålet for de fundne celler, samt midlerne, og standardafvigelsen af foci scoret.

Representative Results

Til denne protokol blev humane perifere blodmonnukleare celler (PC’er) isoleret fra fuldblod fra fire raske voksne frivillige og blev udsat for strålingsdoser på 0,125, 0,250, 0,500, 1.000 og 2.000 Gy. Derefter blev prøverne inkuberet i 1 time ved 37 °C i en befugtet 5% CO 2-inkubator. Efter fiksering og immunofluorescence farvning scannes og scores diasene automatisk. Figur 6,7 og 8 giver en repræsentation af, hvad softwaren udsender til brugeren. Der vises et analysevindue, når scanningen er fuldført, hvilket giver et overblik over den scorede foci. Galleriet giver alle foci scoret med en interaktiv menu, der kan slette outliers og endelig et histogram med en detaljeret dataoversigt er givet. Γ-H2AX foci-udbyttet efter eksponering for γ stråler er vist i figur 9. Der var en gradvis stigning i antallet af γ-H2AX foci med stigende dosis. Denne graf illustrerer ikke kun analysens dosisafhængighed og følsomhed, men pasformen kan også bruges til at udføre en dosisestimering, når en prøve modtages fra en person, der har været udsat for en ukendt dosis. Det er vigtigt at bemærke, at man ikke vil have sham-bestrålet kontrol eller baggrund foci niveauer for denne person. Figur 9 indeholder derfor 0 Gy-værdien af de bestrålede kontrolprøver på 0,57 ± 0,23 Gy for de fire voksne donorer i denne undersøgelse. Figur 1: Fremstilling af lysbilleder til cytocentrifugering. Placer diaset i klipholderen, tilføj filterkortet oven på det, og til sidst tragten. Fastgør glideclipsene, og placer dem i cytocentrifugen. Efter cytocentrifugering fjernes diaset fra klippeholderen og tegner en cirkel rundt om stedet med cellerne ved hjælp af en hydrofob pen. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Den automatiserede scanningsplatform, der blev brugt i denne protokol, og som indeholder en automatiseret scanner, der er knyttet til et fluorescerende mikroskop. Figur 3: Menu til diasopsætning. Åbn dialogen ved at klikke på knappen INSTALLATION i margenteksten. Vælg eller angiv destinationsmappen for resultatfilerne Klik her for at få vist en større version af dette tal. Figur 4: Menuen Opsætning af klassificering. Sørg for, at de valgte klassificeringsindstillinger svarer til prøvens aktuelle celletype, forberedelsesbetingelser og farvningsmønstre. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5: Menuen Opsætning til manuelt søgevindue. Vinduet blev valgt i diasopsætningen. der vil blive åbnet en dialog, der giver mulighed for bestemmelse af scanningsområdet. Ved hjælp af 10x-målsætningen vælges det rektangulære søgeområde på diaset interaktivt ved at fastgøre to hjørner af søgefeltet med venstre klik med musen. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 6: Analysevindue, når scanningen er afsluttet, viser analysevinduet resultaterne af scanningen. Figur 7: Gallerivisning for det markerede dias. Fanen Galleri findes på sidelinjen. Billedgalleriet består af små billeder af de fundne celler, der vises som et kombineret DAPI-TRITC-billede. I nederste venstre og højre hjørne af hvert billede vises det direkte foci-antal og de korrigerede foci-antal. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 8: Histogrambilleder til det valgte dias. Dette vindue åbnes ved at højreklikke på histogrammet. Ved at klikke på histogrammet giver histogrammetabarket en dataoversigt, der viser middel-, standardafvigelsen, variationskoefficienten, minimum-, maksimums- og medianværdierne for de analyserede celler. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 9: Antallet af γ-H2AX foci som funktion af dosis for lymfocytter udsat for 60Co γ-stråler. Fejllinjerne er de standardafvigelser, der repræsenterer den interindividuelle variation blandt donorerne. Data repræsenterer det gennemsnitlige antal γ-H2AX foci ± standardafvigelse for fire raske frivillige. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver en trinvis procedure for den automatiserede fluorescerende mikroskopi-baserede scoring af γ-H2AX foci assay. Det illustrerer nytten af foci-analysen som en tidseffektiv metode til analyse af antallet af strålingsinduceret DNA DSB i perifere blodlymfocytter til at udføre en biologisk dosisvurdering i et strålingsulykkesscenarie, hvor enkeltpersoner kan blive udsat for ukendte niveauer af IR.

I denne specifikke protokol blev PBMCs bestrålet in vitro for at efterligne en in vivostrålingseksponering. Når bestrålingen og inkubationstiden på en time er afsluttet, slides er lavet ved hjælp af en cytocentrifuge til at skabe en koncentration stedet for celler på diaset. Brugen af en cytocentrifuge er afgørende for at opnå standardiserede betingelser for automatiseret scoring. Når den er færdig, bruges en hydrofob pen til at lave en cirkel omkring cellerne for at reducere spild af reagenser ved at give brugeren mulighed for at lokalisere farvningsreagenserne. Denne type pen kan anvendes i forskellige immunstaining teknikker såsom på paraffin sektioner, frosne sektioner og cytologi præparater. Desuden er det vigtigt at vælge en hydrofob pen, som er kompatibel med enzym- og fluorescerende detektionssystemer. Efter diaspræparation opstod fikseringen og immunofluorescens γ-H2AX farvning. I denne protokol er cellerne faste ved hjælp af 3% PFA i en PBS-løsning i 20 minutter. For at immunstaining skal lykkes, er det vigtigt, at cellernes morfologi bevares, og at de antigene steder er tilgængelige for de detektionsreagenser, der anvendes. PFA er et relativt skånsomt middel til fiksering og stabiliserer celler, samtidig med at^{proteinstrukturerne bevares 51}. Optimeringseksperimenter med højere PFA-koncentrationer og længere fikseringstider resulterede i en negativ indvirkning på diaskvaliteten, men yderligere opbevaring (natten over) i 0,5% PFA op til 24 timer gav gode resultater.

Det primære, 2F3 monoklonale antistof, der anvendes i denne protokol, reagerer på histonevarianten H2AX, når fosforyleres ved Serin 139 efter DNA DSB induktion. Antistoffet er i stand til at binde sig til den fosforylerede rest uden krydsreaktivitet med andre fosforylerede histoner⁵². Da dette er et primært musemonolonalt antistof, blev der valgt et sekundært antistof mod værtsarten af det primære antistof, mens det blev opdrættet i en alternativ vært, nemlig æsel-anti-mus (DAM)-TRITC. Mens immunofluorescent farvning er baseret på specifikke antistof-epitop bindende, flere intermolekylære kræfter kan også resultere i ikke-specifikke baggrund farvning. For at reducere ikke-specifik binding er det vigtigt at anvende et blokerende reagens i immunfluorescent farvningsprotokol⁵³; vi brugte en BSA-løsning. Desuden bør der afsættes tilstrækkelig tid til dette blokeringstrin ved at lade lysbillederne være i opløsningen i mindst 20 minutter før farvning af primære og sekundære antistoffer. Derudover bør BSA-opløsningen også anvendes som fortyndingsstof til de primære og sekundære antistoffer. Afhængigt af anti-γ-H2AX og sekundært antistof, der anvendes til farvningen, bør man overveje at teste forskellige antistoffortyndinger for at bestemme den optimale koncentration. For mere præcis scoring kan der foretages en dobbelt farvning ved at tilføje yderligere DNA DSB reparere proteinantistoffer.

En væsentlig ulempe ved denne type analyse er behovet for at erhverve blodprøver så hurtigt som muligt efter eksponeringen, da det maksimale antal foci er kendt for at falde tilbage til det normale niveau inden for 48 timer efter bestråling. Når tidspunktet for strålingsulykken og efterfølgende blodprøvetagning er kendt, kan det derfor være nyttigt at arbejde med forskellige kalibreringskurver, der er blevet etableret på forskellige tidspunkter efter in vitro-bestråling (f.eks. 4, 8, 12 og 24 timer). Men som allerede nævnt i introduktionsafsnittet af manuskriptet ligger styrken af γ-H2AX foci-analysen i indledende, hurtige triageformål, og den bør bruges til at prioritere mere tidskrævende cytogenetisk biologisk dosimetri. Et kombineret scenario, hvor flere biodosimetry biomarkører anvendes parallelt, vil generere de mest pålidelige dosis skøn og forskellige biodosimetry laboratorier over hele verden er gået sammen om at oprette landsdækkende netværk, der kan aktiveres og bruges til at tillade flere, parallelle biodosimetry vurderinger af laboratorier med forskellig ekspertise^37,54,55 . Derudover er der udvikling i gang for superhurtig analyse såsom et mobilt laboratorium på eller i nærheden af ulykkesstedet⁵⁶. Nye, lovende biodosimetry metoder er konstant ved at blive udviklet, hvilket forhåbentlig vil resultere i endnu hurtigere og mere pålidelige gennemløb i fremtiden⁵⁷.

Til det automatiserede billedanalysesystem indsættes eller placeres dias på den automatiserede scanningsplatform eller slidestadiet. Derefter skal du navngive og gemme diasoplysningerne i den relevante mappe på den tilsluttede computer. Til dette eksperiment er automatiseret kerne- og fociregistrering baseret på de respektive klassificeringsindstillinger. Når du opretter en klassificering, skal du sikre dig, at de valgte klassificeringsindstillinger svarer til den aktuelle celletype, forberedelsesbetingelserne og immunofluorescent farvning af prøven. Passende fluorescerende kanaler, der matcher excitationsspektret for de primære og sekundære antistoffer, er indstillet i klassificeringen. Klassificeringen giver mulighed for at indstille yderligere scoringsparametre, hvis det er nødvendigt (f.eks. kernestørrelse, fluorescerende intensitet som beskrevet i afsnit 6.1). Hvis to eller flere DNA-reparationsproteiner (f.eks. γ-H2AX og 53BP1) kombineres i et eksperiment, er systemet også i stand til at opdage co-lokaliseringer af signaler. For det første erhverver systemet DAPI-billeder, anvender billedbehandling og identificerer kerner ved hjælp af morfologiske kriterier, der er angivet i klassificeringen. TRITC-signalerne erhverves ved hjælp af 10 z-stakke med en trinstørrelse på 0,35 mm mellem brændplanerne⁴⁷. Klassificeringen brugte Direct Foci Count, hvor antallet af forskellige TRITC-signaler i kernen er scoret. Her er det vigtigt at tage i betragtning, at med stigende strålingsdosis har foci-signaler tendens til at fusionere til større objekter, hvilket resulterer i en undervurdering af det faktiske foci-nummer, hvis objekter tælles direkte. Det var ikke nødvendigt for den analyse, der er beskrevet her, men et ekstra trin med Korrigeret Foci Count kan implementeres for at løse dette problem. Sidstnævnte gør det muligt for systemet at opnå størrelsen af de registrerede signaler og vejer dem i overensstemmelse hermed. Ved hjælp af begge optællingsmetoder kan give en mere realistisk vurdering af det faktiske antal foci ved højere doser.

For at starte automatiseret scanning bestemmes scanningsområdet ved at bruge mikroskopets 10x-mål til at oprette et rektangulært søgeområde ved at fastgøre to hjørner af søgefeltet ved venstre klik med musen (Figur 5), efterfulgt af at fokusere startpositionen. Referenceobjektet vælges automatisk, og softwaren beder brugeren om at fokusere og centrere en referencekerne (ved hjælp af 40x-målsætningen) for hvert dias. Når søgningen er startet, flyttes systemet til midten af søgevinduet i det første markerede dias og anmoder om at centrere og fokusere referenceobjektet. Dette objekt bruges senere som en positionsreference til at rette eventuelle skift i cellens positioner. Det andet formål med referencefeltet er den automatiske lysjustering, i transmitteret lystilstand justeres lyset, indtil det optimale lysniveau er nået. I fluorescenstilstand er lysniveauet fast, men integrationstiden for CCD-kameraet kan øges, indtil det krævede signal måles. For at muliggøre en korrekt lysjustering skal referencen indeholde objekter med typisk farvning. Det er vigtigt ikke at bruge et felt, der har artefakter med meget høj farvning intensitet. Efter lysjusteringen starter systemet gitterets autofokus på den gitterposition, der er tættest på referencefeltet. Det fortsætter med at fokusere felter på et almindeligt gitter, bevæger sig i en bugte mod forsiden og bagsiden af søgevinduet. Scanningen begynder, når gitterets autofokus er fuldført. Scenen flyttes i et meandermønsterfelt efter felt for at hente data. Når der registreres en celle, gemmes dens placering og galleribillede på skærmen, og celletallet opdateres. Hvis der opstår en mikroskop-, fase- eller feederfejl, annulleres søgningen automatisk. Det eneste trin, hvor der er en manuel indgriben fra operatøren, er under diasscanningsopsætningen. Dette er også det punkt, hvor en hurtig kvalitetskontrol kontrol finder sted (luftbobler, lave celletal, fading af fluorescerende signal farvning artefakter), og hvor det kan besluttes at afbryde scanningen af et dias af ringere kvalitet. En søgning afsluttes, hvis hele diaset er blevet scannet, hvis det maksimale celleantal er nået, eller hvis søgningen er blevet annulleret. Når scanningen er afsluttet, præsenteres dataene som set i Figur 6. Hvis du vil have vist scannede celler, åbnes vinduet Galleri, og hver celle kan vises (Figur 7). Dette er et andet punkt, hvor operatøren kan udføre en kvalitetskontrol ved at kontrollere fokus for galleriet billeder og det samlede antal celler, der er blevet scoret. Hvis systemet har registreret for mange celler, eller der blev registreret for få celler til at foretage en realistisk dosisestimering (f.eks. 100 celler i stedet for de tilsigtede 1000 celler), bør det besluttes at udelukke diaset og den automatiske score fra den endelige evaluering. Alle data er opsummeret i histogrammer (Figur 8), sammen med oplysninger om fordelingen, midlerne og standardafvigelsen for foci scoret for hver celle. Histogrammerne kan også bruges til at udvælge og vise underpopulationer af kerner baseret på de automatiserede resultater til gennemgang. Statistiske analyser af resultaterne udføres efter fordelingen, middelværdi og standardafvigelsen for tallet foci pr. celle er blevet registreret manuelt. Grafen kan bruges som en kalibreringskurve til at foretage en dosisestimering af en biodosimetryprøve. Dette kan gøres ved hjælp af ligningen af tendenslinjen for at foretage en omtrentlig vurdering af den modtagne dosis. Desuden Figur 9 illustrerer, at den automatiserede scanning er følsom nok til at opdage foci induceret ved lave doser. Desuden viser resultaterne en klar lineær stigning i antallet af foci pr. celle med dosis. Det skal bemærkes, at resultaterne kun er repræsentative for den anvendte klassificering, resultaterne vil variere for forskellige klassificeringsparametre. I tilfælde af en biodosimetryanalyse er det derfor vigtigt, at det samme klassificerings- og diaspræparat anvendes til biodosimetryprøverne som dem, der er blevet brugt til at etablere den kalibreringskurve, der bruges til at udføre dosisestimering. Selv om det var uden for rammerne af denne undersøgelse, er det vigtigt at bemærke, at γ-H2AX foci assay også kan bruges til at bestemme delvise organ bestråling. De fleste utilsigtede strålingseksponeringer er inhomogene eller delvise kropseksponeringer, hvor kun en lokaliseret region af kroppen fik en høj dosiseksponering. Flere undersøgelser viste, at det er muligt at anvende γ-H2AX foci-analysen til at estimere den del af kroppen, der er blevet bestrålet, og dosis til den bestrålede fraktion⁴². Når en helkropsbestråling finder sted, vil der være tilfældig induktion af DNA DSB i alle celler, og man kan forvente at finde en Poisson-fordeling. Svarende til cytogentiske metoder, hvor induktion af kromosom aberrationer tendens til at være over spredt i perifere blod lymfocytter, hvor der er en høj overflod af celler med flere afvigelser og celler med normale metafager, spredning analyse af γ-H2AX foci ved hjælp af en forurenet Poisson metode foreslået over spredte foci distributioner⁵⁸. Sidstnævnte blev også bekræftet i in vivo eksperimenter med minipigs og en rhesus makak⁵⁹.

Materials

Bovine serum albumin – BSA	Merck	A3059
Coplin Jar	Sigma	S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm)	Lasec	Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL)	WhiteSci	607101
Cytospin	Healthcare Technologies	JC370-12-L
Cytospin Clips	Healthcare Technologies	JC302
Cytospin filter cards	Healthcare Technologies	JC307
Cytospin Funnels	Healthcare Technologies	JC372
DAM-TRITC	Invitrogen	A16022
DAPI-Fluroshield	Sigma/Merck	F6057
Ethanol	Kimix	ETD901
Filter tips	WhiteSci	200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl	Merck
Histopaque	Sigma/Merck	10771
lithium–heparin collection tubes	The Scientific Group	367526
MetaSystems – Metafer	Metasystems	Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH	Merck	221465
NovoPen	Leica Biosystems	NCL-PEN
Paraformaldehyde	Sigma/Merck	158127
Phosphate-buffered saline Tablets	Separations	SH30028,02
Pipettes	WhiteSci	P11037 and P1033	X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613402 / 100 μg
RPMI medium	WhiteSci	BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Sigma/Merck	T-9284
Tubes (15ml)	WhiteSci	601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped	SMM Technologies	3800200E