यह प्रोटोकॉल परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स पर γ-H2AX फोसी परख की स्लाइड तैयारी और स्वचालित स्कोरिंग प्रस्तुत करता है। परख की विधि और संवेदनशीलता को समझाने के लिए, विट्रो मेंअलग-थलग लिम्फोसाइट्स को विकिरणित किया गया था। डीएनए डीएसबी डिटेक्शन की यह स्वचालित विधि तेज और उच्च थ्रूपुट जैविक दोसिमेत्री अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है।
आयनीकरण विकिरण डीएनए क्षति का एक शक्तिशाली प्रेरक और एक अच्छी तरह से प्रलेखित कार्सिनोजन है। जैविक डोसिमेट्री में व्यक्तिगत खुराक मूल्यांकन करने के लिए आयनीकरण विकिरण के संपर्क में आने से प्रेरित जैविक प्रभावों का पता लगाना शामिल है। यह विकिरण आपात स्थिति के ढांचे में प्रासंगिक है, जहां स्वास्थ्य आकलन और उजागर पीड़ितों के लिए नैदानिक उपचार की योजना महत्वपूर्ण हैं । चूंकि डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति का सबसे घातक रूप माना जाता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल रक्त नमूनों में डीएनए डीएसबी का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह कार्यप्रणाली फ्लोरोसेंट लेबल वाले फॉस्फोरिलेटेड डीएनए रिपेयर प्रोटीन, नामत γ-एच2एक्स का पता लगाने पर आधारित है । प्रति सेल γ-एच2एएक्स फोसी की संख्या स्कोर करने के लिए एक स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग टर्न-अराउंड समय में महत्वपूर्ण कमी के साथ एक मानकीकृत विश्लेषण की अनुमति देता है। इसलिए, γ-H2AX परख जैविक dosimetry के लिए सबसे तेज और संवेदनशील परख में से एक होने की क्षमता है । इस प्रोटोकॉल में, स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों से पूरे रक्त नमूनों को संसाधित किया जाएगा और बायोडोसिमिट्री अनुप्रयोगों के लिए स्वचालित और संवेदनशील γ-H2AX फोसी परख के उपयोग को समझाने के लिए विट्रो में विकिरणित किया जाएगा। एक एकीकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ एक स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग सिस्टम और विश्लेषण मंच का उपयोग किया जाता है, जो पूर्वाग्रह की कम डिग्री के साथ डीएनए डीएसबी के तेज, स्वचालित स्कोरिंग की अनुमति देता है।
अपनी खोज के बाद से, आयनीकरण विकिरण (आईआर) वर्तमान चिकित्सा और औद्योगिक प्रथाओं में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है, साथ ही कृषि और सैन्य अनुप्रयोगों में भी। हालांकि, आईआर के व्यापक उपयोग से पेशेवर विकिरण श्रमिकों के साथ-साथ जनता के सदस्यों के लिए विकिरण ओवरएक्सपोजर का खतरा भी बढ़ जाता है। आईआर एक प्रसिद्ध भौतिक कैंसरकारक है जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष तरीके से डीएनए क्षति को प्रेरित कर सकता है, जिससे महत्वपूर्ण स्वास्थ्य जोखिम 1,2हो सकते हैं। इसलिए, खुराक मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक्सपोजर की डिग्री विकिरण दुर्घटना 1के प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम बनाती है।
बड़े पैमाने पर परमाणु या रेडियोलॉजिकल आपात स्थिति की स्थिति में, खुराक आकलन की संख्या है कि प्रदर्शन की जरूरत है कुछ से हजारों लोगों को दुर्घटना के आकार के आधार पर रेंज कर सकते हैं3। इन परिदृश्यों में, भौतिक डोसिमेट्री भी अस्पष्ट हो सकता है (उदाहरण के लिए, यदि डोसिमीटर ठीक से नहीं पहना जाता है) या अनुपलब्ध, जब जनता के सदस्य शामिल होते हैं। जबकि नैदानिक लक्षणों ट्राइएज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वे जरूरी विकिरण विशिष्ट नहीं है और एक झूठी निदान में परिणाम कर सकते हैं । इसलिए, भौतिक डोसिमेट्री और नैदानिक आकलन के साथ जैविक डोसिमेट्री का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। यह विधि सेलुलर स्तर पर विकिरण-प्रेरित परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है और उन उजागर व्यक्तियों की स्पष्ट पहचान को सक्षम बनाती है जिन्हें चिकित्सा उपचार की आवश्यकता होती है4। चिकित्सक तो इस जैविक खुराक मूल्यांकन का उपयोग करने के लिए शारीरिक खुराक पुनर्निर्माण और अंय नैदानिक निदान पूरक कर सकते हैं, ताकि उचित चिकित्सा देखभाल5लिख । जैविक dosimetry के लिए की जरूरत विशेष रूप से त्रई और हताहतों की चिकित्सा प्रबंधन के लिए उच्च होगा जब जोखिम परिदृश्य अच्छी तरह से जाना जाता है और जब पीड़ितों को जनता के सदस्य हैं । ट्राइएज का मुख्य उद्देश्य “चिंतित अच्छी तरह से’ व्यक्तियों को प्रभावी ढंग से अलग करना है, जिनके पास प्रोड्रोमल लक्षण हो सकते हैं, लेकिन जिन्हें उच्च खुराक प्राप्त नहीं हुई, तत्काल चिकित्सा सहायता और विशेष देखभाल की आवश्यकता वाले उजागर व्यक्तियों से। विकिरण खुराक का सीमा स्तर जो विकिरण बीमारी का कारण बन सकता है वह लगभग 0.75 – 1.00 Gy है। फिर, जिन व्यक्तियों को > 2 जीवाई ऑफ एक्सपोजर प्राप्त होता है , उन्हें तीव्र विकिरण सिंड्रोम के लिए अधिक खतरा होता है और उन्हें त्वरित चिकित्सा उपचार प्राप्त करना चाहिए6,7. ऐसी आपदाओं की गोलीबारी में पकड़े गए पीड़ितों के लिए समय पर और सटीक जैविक खुराक का अनुमान महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, यह भी आराम और न्यूनतम उजागर पीड़ितों को आश्वस्त कर सकते हैं8।
विकिरण संरक्षण प्राधिकरण विभिन्न बायोडोसिमेट्री मार्कर का उपयोग करते हैं, जो मुख्य रूप से सुसंस्कृत मानव लिम्फोसाइट्स9में साइटोजेनेटिक क्षति, जैसे डाइसेंट्रिक गुणसूत्रों या माइक्रोन्यून्यूक्लियी का पता लगाने पर आधारित होते हैं। साइटोजेनेटिक क्षति का पता10 सीटू संकरण (मछली) स्थानांतरण परख में फ्लोरोसेंट द्वारा भी किया जा सकता है। हालांकि, पारंपरिक साइटोजेनेटिक तरीकों की प्रमुख खामी आपातकालीन स्थिति में परिणाम प्राप्त करने के लिए लंबा बदलाव समय है8।
डीएनए डीएसबी मान्यता प्रक्रिया में शुरुआती चरणों में से एक हिस्टोन संस्करण एच2एक्स का फॉस्फोरिलेशन है, जिससे γ-एच2एक्स का गठन होता है, और मरम्मत कारकों की बाद की भर्ती होती है। पिछले एक दशक में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में विकिरण-प्रेरित γ-एच2एक्स फोसी का पता लगाने से एक विश्वसनीय जैविक डोसिमेट्री उपकरण11, 12,13,14,15के रूप में बढ़ता हुआ ध्यान मिला है। विकिरण की गुणवत्ता और कोशिका प्रकार के आधार पर, विकिरण16, 17के बाद 0.5 – 1 घंटे के भीतर γ-एच2एक्स फोसी की अधिकतम उपज का पता लगायाजाताहै। यह अनुमान लगाया गया है कि डीएनए डीएसबी और γ-एच2एक्स फोसी की संख्या के साथ-साथ फोसी और डीएसबी मरम्मत के गायब होने के बीच घनिष्ठ संबंध है। एक स्पंदित लेजर माइक्रोबसम के साथ लेजर कैंची प्रयोगों ने दिखा दिया है कि γ-एच2एक्स फोसी डीएनए डीएसबी18की साइटों पर स्थानीयकृत हैं। हालांकि यह सक्रिय बहस का विषय बना हुआ है, 125के साथ शुरुआती अध्ययनों में से एक मैंने प्रति कोशिका विघटन की गणना संख्या (विकिरण-प्रेरित डीएनए डीएसबी की संख्या के लिए प्रतिनिधित्व करने योग्य) और γ-एच2एक्स फोसी की संख्या के बीच एक-से-एक संबंध का सुझाव दिया जो19,20रन बनाए गए थे।
पिछले एक दशक में, यूरोपीय संघ ने जैविक और पूर्वव्यापी डोसिमेट्री में एक टिकाऊ नेटवर्क बनाने के लिए मल्टीबायोडोज (उच्च पैमाने पर रेडियोलॉजिकल हताहतों का प्रबंधन करने के लिए बहु-अनुशासनात्मक बायोडोसिमेट्रिक उपकरण) और रेनेबी (बायोडोसिमेट्री के यूरोपीय नेटवर्क को साकार करने) परियोजनाओं को वित्त पोषित किया21,22. इस परियोजना में रेडियोलॉजिकल आपातकाल की स्थिति में आपातकालीन प्रतिक्रिया क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए पूरे यूरोप में विभिन्न प्रयोगशालाएं शामिल थीं14,21,22. γ-H2AX foci परख में कई फायदे हैं, जैसे कि तेजी से प्रसंस्करण का समय, उच्च थ्रूपुट के लिए अनुमति देने वाले बैच प्रसंस्करण की क्षमता, साथ ही एक्सपोजर के बाद कुछ घंटों के भीतर उपयोग की जाने वाली इसकी उच्च संवेदनशीलता13,23,24. कम खुराक सीमा में परख की उच्च संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप कई अध्ययन हुए जहां γ-एच2एक्स फोसी परख का उपयोग रेडियोथेरेपी के साथ-साथ नैदानिक इमेजिंग अनुप्रयोगों दोनों में चिकित्सा विकिरण जोखिम के प्रभाव के संकेतक के रूप में किया गया था25,26,27,28,29,30. इन विशेषताओं γ-H2AX foci परख बड़े परमाणु दुर्घटनाओं में जल्दी त्रई के लिए अंय तरीकों के लिए एक अत्यधिक प्रतिस्पर्धी विकल्प बनाने के लिए गंभीर रूप से कम जोखिम वाले व्यक्तियों से उजागर अलग । कई अनुकूलन प्रयोगों ने स्पष्ट किया है कि रक्त की छोटी मात्रा के साथ γ-एच2एक्स फोसी परख करना संभव है, जैसे कि मोकेट एट अल का अध्ययन। जिन्होंने बताया कि रक्त की केवल एक बूंद (उंगली चुभन) के साथ γ-H2AX फोसी परख करना संभव है31. इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग पूरी तरह से स्वचालित उच्च-थ्रूपुट रैबिट (रैपिड ऑटोमेटेड बायोडोसिमेट्री टूल) प्रणाली के विकास में किया गया था जिसे रक्त के फिंगरस्टिक-व्युत्पन्न नमूनों से γ-H2AX पैदावार को मापने के लिए अनुकूलित किया गया था।32,33. कुल मिलाकर, मल्टीबायोडोज और रेनेबी अंतर-तुलना अध्ययनों के परिणाम बताते हैं कि γ-एच2एएक्स फोसी परख हाल ही में (24 घंटे तक) तीव्र विकिरण जोखिम के बाद एक बहुत ही उपयोगी ट्राइएज उपकरण हो सकता है12,13,14. एक कम खुराक रेंज अंतर तुलना अध्ययन में, 10 mGy के रूप में कम के रूप में एक खुराक नकली-विकिरणित नियंत्रण नमूनों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, कम खुराक रेंज में परख की संवेदनशीलता पर प्रकाश डाला34. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परख की उच्च संवेदनशीलता लिम्फोसाइट्स के लिए विशेष रूप से सच है, जो उन्हें कम खुराक वाले एक्सपोजर के मूल्यांकन के लिए सबसे उपयुक्त सेल प्रकारों में से एक बनाता है। लिम्फोसाइट्स मुख्य रूप से गैर-साइकिल कोशिकाएं हैं और एक समकालिक आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं। बाद γ की अभिव्यक्ति से बचा जाता है-H2AX डीएनए प्रतिकृति के साथ जुड़ा हुआ है, जो काफी परख की संवेदनशीलता को कम कर देता है के लिए विकिरण का पता लगाने के लिए G2 और सेल चक्र के एस चरण के दौरान DSB प्रेरित35. लिम्फोसाइट्स के लिए कम खुराक के प्रति इसकी संवेदनशीलता के अलावा, γ-एच2एक्स फोसी परख का बदलाव का समय डाइसेंट्रिक और माइक्रोन्यूक्लिस परख जैसी साइटोजनेटिक तकनीकों की तुलना में काफी तेज है, क्योंकि इसके लिए लिम्फोसाइट्स की उत्तेजना की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, साइटोजेनेटिक तकनीकों के लिए कुछ दिनों की तुलना में कुछ घंटों के भीतर परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। परख की एक बड़ी खामी γ-H2AX फोसी सिग्नल का तेजी से गायब होना है, जो आम तौर पर डीएनए मरम्मत काइनेटिक्स के आधार पर विकिरण जोखिम के बाद दिनों के भीतर बेसलाइन स्तर तक कम हो जाएगा36. इसलिए, बायोडोसिमेट्री संदर्भ में परख का सबसे उपयुक्त अनुप्रयोग प्रारंभिक ट्राइएज उद्देश्यों के लिए है और कुछ पीड़ितों के लिए अधिक समय लेने वाली साइटोजेनेटिक जैविक डोसिमेट्री अनुवर्ती को प्राथमिकता देना है। हालांकि, सटीक पूर्वव्यापी बायोडोसिमेट्री और दीर्घकालिक प्रभावों के लिए, किसी को कई साल पहले एक्सपोजर होने की स्थिति में स्थिर गुणसूत्र विपथनों का पता लगाने के लिए तीन रंग की मछली विश्लेषण जैसी साइटोजेनेटिक तकनीकों पर निर्भर रहना पड़ता है।10.
कई बायोडोसिमेट्री पहलों के हिस्से के रूप में, बड़े पैमाने पर रेडियोलॉजिकल आपात स्थितियों में लोगों को ट्राइएज करने के लिए γ-एच2एक्स फोसी परख के बगल में ट्राइएज उद्देश्यों के लिए कई परखों का मूल्यांकन किया गया है; जैसे डिसेंट्रिक्स परख, साइटोकिनेसिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लिस परख, इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेच (ईपीआर), सीरम प्रोटीन परख (एसपीए), त्वचा स्पेक्टल परख (एसएसए), ऑप्टिकली उत्तेजित ल्यूमिनेसेंस (ओएसएल), साथ ही जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 37,38। γ-H2AX foci परख डीएनए डीएसबी गठन और मरम्मत३९के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, परख समय पर निर्भर है क्योंकि डीएनए डीएसबी मरम्मत काइनेटिक्स40के कारण विकिरण के बाद γ-एच2एक्स फोसी का स्तर समय के साथ बदलता रहता है। एक तुलनात्मक अध्ययन सचित्र है कि जेड चरण क्षमता के साथ सूक्ष्म स्कोरिंग विकिरण के 1 Gy के बाद सबसे सटीक परिणाम प्रदान करता है, जबकि प्रवाह साइटोमेट्री केवल आईआर४१की उच्च खुराक पर विश्वसनीय परिणाम देता है । 42 , 43,44 ,45,46में उपयोग के लिए छवि विश्लेषणसमाधानोंके विकास की कई रिपोर्टें हैं। इस प्रोटोकॉल में, परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में γ-एच2एक्स फोसी का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग किया जाता है। एक स्वचालित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग अंतर-प्रयोगशाला और अंतर-पर्यवेक्षक स्कोरिंग पूर्वाग्रह दोनों से बचा जाता है, जबकि यह अभी भी 1 Gy47से नीचे की खुराक का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता की अनुमति देता है। फोसी स्कोरिंग के लिए मुफ्त ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर की तुलना में इस प्रणाली का प्राथमिक लाभ यह तथ्य है कि स्लाइड की स्कैनिंग से कैप्चरिंग और स्कोरिंग तक पूरी प्रक्रिया स्वचालित है। उपयोगकर्ता-परिभाषित और स्टोर करने योग्य क्लासिफायर की अवधारणा प्रजनन क्षमता की गारंटी देती है जो परिणामों में गुणवत्ता की निष्पक्ष डिग्री जोड़ती है। इसलिए, यह काम दिखाता है कि कैसे γ-H2AX फोसी परिणाम एक स्वचालित सूक्ष्म स्कैनिंग और स्कोरिंग विधि का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जिसका उपयोग तब किया जा सकता है जब संभावित रूप से अधिक उजागर व्यक्तियों से रक्त नमूने जैविक डॉसिमेट्री उद्देश्यों के लिए रेडियोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त किए जाते हैं।
यह प्रोटोकॉल γ-एच2एक्स फोसी परख के स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी-आधारित स्कोरिंग के लिए एक स्टेपवाइज प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह एक विकिरण दुर्घटना परिदृश्य में जैविक खुराक मूल्यांकन करने के लिए परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में विकिरण प्रेरित डीएनए डीएसबी की संख्या का विश्लेषण करने के लिए एक समय कुशल विधि के रूप में फोसी परख की उपयोगिता दिखाता है जहां व्यक्तियों को आईआर के अज्ञात स्तरों से अवगत कराया जा सकता है।
इस विशिष्ट प्रोटोकॉल में, पीबीएमसी को विट्रो में विकिरणित किया गया था ताकि वीवो विकिरण एक्सपोजर में नकल की जा सके। एक बार विकिरण और एक घंटे के इनक्यूबेशन समय पूरा हो जाने के बाद, स्लाइड पर कोशिकाओं की एकाग्रता स्थान बनाने के लिए साइटोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करके स्लाइड बनाई जाती हैं। स्वचालित स्कोरिंग के लिए मानकीकृत स्थितियों को प्राप्त करने के लिए साइटोसेंट्रफ्यूज का उपयोग महत्वपूर्ण है। पूरा होने पर, एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग कोशिकाओं के चारों ओर एक सर्कल बनाने के लिए किया जाता है, ताकि उपयोगकर्ता को धुंधला अभिकर्मकों को स्थानीयकृत करने की अनुमति देकर अभिकर्मकों की बर्बादी को कम किया जा सके। इस प्रकार की पेन का उपयोग पैराफिन सेक्शन, फ्रोजन सेक्शन और साइटोलॉजी की तैयारी जैसे विभिन्न इम्यूनोदाता तकनीकों में किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइड्रोफोबिक पेन का चयन करना महत्वपूर्ण है जो एंजाइम और फ्लोरोसेंट-आधारित डिटेक्शन सिस्टम के साथ संगत है। स्लाइड तैयारी के बाद फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस γ-H2AX धुंधला हुआ । इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए एक पीबीएस समाधान में 3% पीएफए का उपयोग करके तय किया जाता है। सफल होने के लिए, यह आवश्यक है कि कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को बनाए रखा जाए और एंटीजेनिक साइटों का उपयोग किए जा रहे डिटेक्शन रिएजेंट्स के लिए सुलभ हो। पीएफए निर्धारण के लिए अपेक्षाकृत सौम्य एजेंट है और प्रोटीन संरचनाओं के संरक्षण के दौरान कोशिकाओं को स्थिर करता है51. उच्च पीएफए सांद्रता और लंबे समय तक निर्धारण के समय के साथ अनुकूलन प्रयोगों के परिणामस्वरूप स्लाइड गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा, लेकिन 0.5% पीएफए में 24 घंटे तक आगे भंडारण (रातोंरात) अच्छे परिणाम मिले।
इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्राथमिक, 2F3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी डीएनए डीएसबी प्रेरण के बाद सेरीन 139 पर फॉस्फोरिलेटेड होने पर हिस्टोन संस्करण एच2एक्स पर प्रतिक्रिया करता है। एंटीबॉडी अन्य फॉस्फोरिलेटेड हिटोन52के साथ क्रॉस रिएक्टिविटी के साथ फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों से बांधने में सक्षम है। चूंकि यह एक प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है, इसलिए एक वैकल्पिक मेजबान, अर्थात् गधा-एंटी-माउस (DAM) -TRITC में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के खिलाफ एक माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन किया गया था। जबकि इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला विशिष्ट एंटीबॉडी-एपिटोप बाइंडिंग पर आधारित है, कई इंटरमॉलिकुलर बलों के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला भी हो सकता है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए, इम्यूनोफ्लोर्सेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल53में एक अवरुद्ध अभिकर् ता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है; हमने बीएसए समाधान का उपयोग किया। इसके अलावा, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए समाधान में स्लाइड छोड़कर इस अवरुद्ध कदम के लिए पर्याप्त समय आवंटित किया जाना चाहिए। इसके अलावा बीएसए सॉल्यूशन को प्राइमरी और सेकेंडरी एंटीबॉडी के लिए भी डिलुएंट के तौर पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। दागने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटी-γ-एच2एक्स और माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर, इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी कमजोर करने के परीक्षण पर विचार करना चाहिए। अधिक सटीक स्कोरिंग के लिए, अतिरिक्त डीएनए डीएसबी मरम्मत प्रोटीन एंटीबॉडी जोड़कर एक डबल धुंधला किया जा सकता है।
विश्लेषण के इस प्रकार का एक बड़ा नुकसान जोखिम के बाद जितनी जल्दी हो सके रक्त के नमूनों को प्राप्त करने की जरूरत है, के रूप में foci की अधिकतम संख्या के लिए ४८ घंटे के भीतर सामांय स्तर पर वापस कम करने के लिए जाना जाता है विकिरण के बाद । इसलिए, जब विकिरण दुर्घटना और बाद में रक्त नमूने का समय ज्ञात होता है, तो इन विट्रो विकिरण (जैसे, 4, 8, 12 और 24 घंटे) के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर स्थापित किए गए विभिन्न अंशांकन घटता के साथ काम करना उपयोगी हो सकता है। हालांकि, जैसा कि पहले से ही पांडुलिपि के परिचय अनुभाग में उल्लेख किया गया है, γ-एच2एएक्स फोसी परख की ताकत प्रारंभिक, तेज ट्राइएज उद्देश्यों में निहित है और इसका उपयोग अधिक समय लेने वाली साइटोजेनेटिक जैविक डोसिमेट्री को प्राथमिकता देने के लिए किया जाना चाहिए। एक संयुक्त परिदृश्य जहां समानांतर में कई बायोडोसिमेट्री बायोमार्कर का उपयोग कियाजाता है, सबसे विश्वसनीय खुराक अनुमान उत्पन्न करेगा और दुनिया भर में विभिन्न बायोडोसिमेट्री प्रयोगशालाएं राष्ट्रव्यापी नेटवर्क स्थापित करने के लिए सेना में शामिल हो गई हैं जिन्हें सक्रिय किया जा सकता है और विभिन्न विशेषज्ञता37,54, 55के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा कई, समानांतर बायोडोसिमेट्री आकलन की अनुमति देने के लिए उपयोग किया जा सकता है . इसके अलावा, दुर्घटना स्थल56पर या उसके पास मोबाइल प्रयोगशाला जैसे सुपरफास्ट विश्लेषण के लिए विकास चल रहे हैं। नए, आशाजनक बायोडोसिमेट्री तरीकों को लगातार विकसित किया जा रहा है, जिसके परिणामस्वरूप भविष्य में57में और भी तेज़ और अधिक विश्वसनीय थ्रूपुट होगा।
स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणाली के लिए, स्लाइड स्वचालित स्कैनिंग प्लेटफ़ॉर्म या स्लाइड चरण पर डाले जाते हैं या रखे जाते हैं। इसके बाद, संलग्न कंप्यूटर पर उपयुक्त फ़ोल्डर में स्लाइड विवरण का नाम और सेव करें। इस प्रयोग के लिए, स्वचालित नाभिक और फोसी डिटेक्शन संबंधित क्लासिफायर सेटिंग्स पर आधारित है। क्लासिफायर बनाने पर, यह सुनिश्चित करें कि चयनित क्लासिफायर सेटिंग्स वर्तमान सेल प्रकार, तैयारी की स्थिति और नमूने के इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला से मेल खाती हैं। प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के उत्तेजन स्पेक्ट्रम से मेल खाने वाले उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल क्लासिफायर में सेट किए जाते हैं। क्लासिफायर यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त स्कोरिंग पैरामीटर स्थापित करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, नाभिक का आकार, फ्लोरोसेंट तीव्रता, जैसा कि धारा 6.1 में वर्णित है)। यदि दो या अधिक डीएनए मरम्मत प्रोटीन (जैसे, γ-H2AX और 53BP1) एक प्रयोग में संयुक्त कर रहे हैं, प्रणाली भी संकेतों के सह स्थानीयकरण का पता लगाने में सक्षम है । सबसे पहले, सिस्टम DAPI छवियों को प्राप्त करता है, छवि प्रसंस्करण लागू करता है, और क्लासिफायर में सेट रूपात्मक मानदंडों का उपयोग करके नाभिक की पहचान करता है। ट्राईटीसी सिग्नल फोकल प्लेन47के बीच 0.35 मिमी के स्टेप साइज के साथ 10 जेड-स्टैक का इस्तेमाल करते हुए हासिल किए जाते हैं। क्लासिफायर ने डायरेक्ट फोसी काउंट का इस्तेमाल किया, जहां नाभिक के भीतर अलग-अलग ट्राइटीसी संकेतों की संख्या अर्जित की जाती है। यहां, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विकिरण की बढ़ती खुराक के साथ, फोसी सिग्नल बड़ी वस्तुओं में विलय करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक फोसी संख्या का अनुमान लगाया जाता है यदि वस्तुओं को सीधे गिना जाता है। यह यहां वर्णित विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं था, लेकिन इस समस्या को हल करने के लिए सही फोसी काउंट के साथ एक अतिरिक्त कदम लागू किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध सिस्टम को पता लगाया संकेतों के आकार प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है और तदनुसार उनका वजन करता है। दोनों गिनती विधियों का उपयोग उच्च खुराक पर foci की वास्तविक संख्या का एक अधिक यथार्थवादी अनुमान प्रदान कर सकते हैं ।
स्वचालित स्कैनिंग शुरू करने के लिए, स्कैन क्षेत्र माउस के बाएं क्लिक द्वारा खोज क्षेत्र के दो कोनों को ठीक करके आयताकार खोज क्षेत्र बनाने के लिए माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है (अंक 5), शुरू की स्थिति पर ध्यान केंद्रित करने के बाद । संदर्भ वस्तु का चयन स्वचालित रूप से किया जाता है, और सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता को प्रत्येक स्लाइड के लिए संदर्भ नाभिक (40x उद्देश्य का उपयोग करके) केंद्रित करने और केंद्र बनाने के लिए प्रेरित करता है। खोज शुरू होने के बाद, सिस्टम पहले चयनित स्लाइड की खोज खिड़की के केंद्र में जाएगा और संदर्भ ऑब्जेक्ट को केंद्र और केंद्रित करने का अनुरोध करेगा। इस ऑब्जेक्ट को बाद में सेल की स्थिति में किसी भी बदलाव को सही करने के लिए स्थिति संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। संदर्भ क्षेत्र का दूसरा उद्देश्य स्वचालित प्रकाश समायोजन है, प्रेषित प्रकाश मोड में प्रकाश को इष्टतम प्रकाश स्तर तक पहुंचने तक समायोजित किया जाता है। फ्लोरेसेंस मोड में लाइट लेवल तय हो जाता है, लेकिन सीसीडी कैमरे के इंटीग्रेशन टाइम को तब तक बढ़ाया जा सकता है, जब तक जरूरी सिग्नल नहीं मापा जाता। एक सही प्रकाश समायोजन को सक्षम करने के लिए, संदर्भ में विशिष्ट धुंधला के साथ वस्तुओं को शामिल किया जाना चाहिए। यह एक क्षेत्र है जो बहुत उच्च धुंधला तीव्रता के साथ कलाकृतियों है का उपयोग नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रकाश समायोजन के बाद, सिस्टम संदर्भ क्षेत्र के निकटतम ग्रिड स्थिति पर ग्रिड ऑटोफोकस शुरू होता है। यह एक नियमित ग्रिड पर क्षेत्रों को ध्यान केंद्रित करने के लिए जारी है, सामने और खोज खिड़की के पीछे की ओर एक meander में चलती है । ग्रिड ऑटोफोकस पूरा होने पर स्कैनिंग शुरू होती है। डेटा कैप्चर करने के लिए फ़ील्ड के बाद चरण को एक मेंंडर पैटर्न फ़ील्ड में ले जाया जाता है। जब एक सेल का पता चला है, उसकी स्थिति और गैलरी छवि संग्रहीत कर रहे है और स्क्रीन पर प्रदर्शित और सेल गिनती अद्यतन किया जाता है । यदि माइक्रोस्कोप, चरण या फीडर त्रुटि होती है, तो खोज स्वचालित रूप से रद्द हो जाती है। एकमात्र कदम जहां ऑपरेटर से मैन्युअल हस्तक्षेप होता है, स्लाइड स्कैनिंग सेट-अप के दौरान होता है। यह भी बिंदु है जहां एक त्वरित गुणवत्ता नियंत्रण जांच होती है (हवा के बुलबुले, कम सेल नंबर, फ्लोरोसेंट सिग्नल धुंधला कलाकृतियों की लुप्त होती) और जहां इसे अवर गुणवत्ता की स्लाइड की स्कैनिंग को निरस्त करने का फैसला किया जा सकता है। यदि पूरी स्लाइड को स्कैन किया गया है, यदि अधिकतम सेल काउंट पहुंच गया है, या यदि खोज रद्द कर दी गई है, तो खोज समाप्त कर दी गई है। एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, डेटा प्रस्तुत किया जाता है जैसा कि देखा जाता है अंक 6. स्कैन की गई कोशिकाओं को देखने के लिए, गैलरी विंडो खोली जाती है और प्रत्येक कोशिका को देखा जा सकता है (अंक 7). यह एक और बिंदु है जहां ऑपरेटर गैलरी छवियों और कुल कोशिकाओं की कुल संख्या की जांच करके गुणवत्ता नियंत्रण कर सकता है। यदि बहुत अधिक कोशिकाएं फोकस से बाहर हैं या बहुत कम कोशिकाओं को सिस्टम द्वारा यथार्थवादी खुराक अनुमान बनाने के लिए पता लगाया गया था (उदाहरण के लिए, 100 कोशिकाओं के बजाय इच्छित 1000 कोशिकाओं), तो अंतिम मूल्यांकन से स्लाइड और स्वचालित स्कोर को बाहर करने का निर्णय लिया जाना चाहिए। सभी डेटा को हिस्टोग्राम में संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है (अंक 8), वितरण के बारे में जानकारी के साथ, साधन, और प्रत्येक सेल के लिए बनाए गए foci के मानक विचलन। हिस्टोग्राम का उपयोग समीक्षा के लिए स्वचालित निष्कर्षों के आधार पर नाभिक की उप-आबादी का चयन और प्रदर्शन करने के लिए भी किया जा सकता है। परिणामों पर सांख्यिकीय विश्लेषण वितरण, मतलब के बाद किया जाता है, और प्रति सेल संख्या फोसी के मानक विचलन को मैन्युअल रूप से दर्ज किया गया है। ग्राफ का उपयोग बायोडोसिमेट्री नमूने की खुराक अनुमान लगाने के लिए अंशांकन वक्र के रूप में किया जा सकता है। यह प्राप्त खुराक का अनुमान लगाने के लिए ट्रेंड लाइन के समीकरण का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अलावा अंक 9 दिखाता है कि स्वचालित स्कैनिंग कम खुराक पर प्रेरित फोसी का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। इसके अलावा, परिणाम खुराक के साथ प्रति सेल फोसी की संख्या में स्पष्ट रैखिक वृद्धि दिखाते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिणाम केवल उपयोग किए गए क्लासिफायर के लिए प्रतिनिधि हैं, परिणाम विभिन्न क्लासिफायर मापदंडों के लिए अलग होंगे। इसलिए, बायोडोसिमेट्री विश्लेषण के मामले में, यह महत्वपूर्ण है कि एक ही क्लासिफायर और स्लाइड तैयारी का उपयोग बायोडोसिमेट्री नमूनों के लिए किया जाता है क्योंकि कैलिब्रेशन वक्र स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है जिसका उपयोग खुराक अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। हालांकि यह इस अध्ययन के दायरे से बाहर था, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि γ-H2AX foci परख भी आंशिक शरीर विकिरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिकांश आकस्मिक विकिरण एक्सपोजर असंगत या आंशिक शरीर के एक्सपोजर होते हैं, जहां शरीर के केवल एक स्थानीयकृत क्षेत्र को उच्च खुराक एक्सपोजर प्राप्त होता है। कई अध्ययनों से यह स्पष्ट होता है कि γ-एच2एएक्स फोसी परख का उपयोग शरीर के अंश का अनुमान लगाना संभव है जिसे विकिरणित किया गया है और किरणित अंश की खुराक42. जब पूरे शरीर का विकिरण होता है, तो सभी कोशिकाओं में डीएनए डीएसबी का यादृच्छिक प्रेरण होगा और कोई भी पॉइसन वितरण खोजने की उम्मीद कर सकता है। साइटोजेनिक तरीकों के समान जहां क्रोमोसोमल विपथनों का प्रेरण परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में फैलाया जाता है जहां सामान्य मेटाफेस के साथ कई विपथन और कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं की एक उच्च बहुतायत है, दूषित फोसीवियन पर सुझाए गए एक दूषित फॉसन विधि का उपयोग करके γ-एच2एक्स फोसी का फैलाव विश्लेषण58. बाद में भी पुष्टि की थी in vivo मिनीपिग्स और एक रीसस मकाक के साथ प्रयोग59.
The authors have nothing to disclose.
लेखक अध्ययन प्रतिभागियों को उनके रक्तदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही रक्त नमूना संग्रह के लिए नर्स वी प्रिंस । इस शोध के प्रति दक्षिण अफ्रीकी राष्ट्रीय अनुसंधान प्रतिष्ठान (एनआरएफ) की वित्तीय सहायता को स्वीकार किया जाता है । व्यक्त की राय, और निष्कर्ष पर पहुंचे, लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनआरएफ के लिए जिंमेदार ठहराया जा रहे हैं । इस काम को अंतरराष्ट्रीय परमाणु ऊर्जा एजेंसी (आईएईए) द्वारा डब्ल्यू मार्टिनेज-लोपेज़ के साथ-साथ समन्वित अनुसंधान परियोजना E35010 (अनुबंध संख्या: 22248) का समर्थन करने के लिए तकनीकी सहयोग परियोजना (संख्या: URU6042) के माध्यम से आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था।
Bovine serum albumin – BSA | Merck | A3059 | |
Coplin Jar | Sigma | S6016 | |
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) | Lasec | Glass2C29M2450Rec | |
Cryogenic Vials (1.2 mL) | WhiteSci | 607101 | |
Cytospin | Healthcare Technologies | JC370-12-L | |
Cytospin Clips | Healthcare Technologies | JC302 | |
Cytospin filter cards | Healthcare Technologies | JC307 | |
Cytospin Funnels | Healthcare Technologies | JC372 | |
DAM-TRITC | Invitrogen | A16022 | |
DAPI-Fluroshield | Sigma/Merck | F6057 | |
Ethanol | Kimix | ETD901 | |
Filter tips | WhiteSci | 200ul (312012) and 1000ul (313012) | |
Hydrochloric acid- HCl | Merck | ||
Histopaque | Sigma/Merck | 10771 | |
lithium–heparin collection tubes | The Scientific Group | 367526 | |
MetaSystems – Metafer | Metasystems | Azio Imager Z2: 195-041848 | |
NaOH | Merck | 221465 | |
NovoPen | Leica Biosystems | NCL-PEN | |
Paraformaldehyde | Sigma/Merck | 158127 | |
Phosphate-buffered saline Tablets | Separations | SH30028,02 | |
Pipettes | WhiteSci | P11037 and P1033 | X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage. |
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613402 / 100 μg | |
RPMI medium | WhiteSci | BE12-702F | |
Triton X-100 (Octoxinol 9) | Sigma/Merck | T-9284 | |
Tubes (15ml) | WhiteSci | 601002 | |
X-Tra adhesive slides – corner clipped | SMM Technologies | 3800200E |