Preparação de Vírus da Influenza Aviária H5 Pseudotipados com Método de Transfecção de Fosfato de Cálcio e Mensuração da Atividade Neutralizante de Anticorpos
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para empacotamento de pseudovírus e a medição da atividade neutralizante de anticorpos.
Abstract
Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens. Ocasionalmente, os seres humanos também são vítimas dela, o que resulta em alta mortalidade. No entanto, a pesquisa do vírus da GAAP é frequentemente dificultada, considerando que deve ser manuseada dentro de laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus provam ser as ferramentas ideais para estudar anticorpos neutralizantes contra os vírus H5 da GAAP. Este protocolo descreve os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 GAAP e ensaios de neutralização de pseudovírus. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios.
Introduction
Desde 1996, os vírus H5 da linhagem A/ganso/Guangdong/1/96 da gripe aviária de alta patogenicidade (HPAI) têm causado surtos contínuos de gripe em aves de capoeira e aves selvagens, sendo responsáveis por enormes perdas socioeconômicas na indústria avícola global. Algumas vezes, os seres humanos também se infectam com ela, diante de uma alta taxa de letalidade 1,2. No entanto, a pesquisa do vírus da IAAP é frequentemente dificultada, uma vez que não pode ser manuseada fora dos laboratórios de nível de biossegurança 3. Para resolver essa questão, pseudovírus são adotados como uma alternativa aos vírus selvagens em alguns experimentos de estudos de IAAP H5. Os pseudovírus são seguros o suficiente para serem praticados em laboratórios de nível 2 de biossegurança.
Os pseudovírus H5 da GAAP pertencem a vírus quiméricos que consistem em núcleos de vírus substitutos, envelopes lipídicos com glicoproteínas de superfície de vírus influenza e genes repórteres. Os núcleos de pseudovírus são geralmente derivados do vírus da imunodeficiência humana lentiviral (HIV), retrovírus como o vírus da leucemia murina (MLV) e o vírus da estomatite vesicular (VSV)3. Especificamente, o sistema de embalagem do HIV-1 é amplamente utilizado para produzir pseudovírus influenza, onde os genes primários fornecidos são gag e pol. O gene da mordaça do HIV expressa proteínas centrais. O gene pol expressa a integrase e a transcriptase reversa, ambas necessárias para a expressão do gene repórter em células transduzidas. Mimetizando o genoma do vírus substituto, o gene repórter é abraçado no núcleo do pseudovírus na forma de RNA. O gene repórter expressará a proteína nas células hospedeiras. Os níveis de expressão gênica dos genes repórteres podem ser usados para medir a eficiência da infecção por pseudovírus 3,4. O repórter primário é a luciferase de vagalume para medir as unidades de luminescência relativa (RLU) ou atividade relativa de luciferase (RLA) em células transduzidas. Outros repórteres como lacZ, Gaussia e Renilla luciferase também são usados, só que em menor grau5.
Os pseudovírus são ferramentas ideais para o estudo de anticorpos neutralizantes contra o vírus H5 HAPI. Para medir a potência do anticorpo neutralizante, ensaios de neutralização de pseudovírus (NP)6 são usados. A hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) são glicoproteínas da superfície do vírus influenza A 7,8. O AH é composto por um domínio da cabeça globular para ligação ao receptor e um domínio do tronco para fusão da membrana. A proteína NA tem atividade de sialidase para facilitar a liberação do vírus 7,8. Um ensaio de NP pode medir anticorpos neutralizantes direcionados às proteínas HA. Anticorpos neutralizantes direcionados para a região da cabeça e tronco do AH também podem ser detectados por ensaios de adesão e entrada viral. Em comparação com vírus selvagens, os experimentos de neutralização de pseudovírus têm valores de detecção mais sensíveis, podem ser manuseados com segurança em um laboratório de biossegurança de nível 2 e geralmente são mais fáceis de operar na prática.
Este protocolo apresenta em detalhes os procedimentos e etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 da GAAP e ensaios de NP. Além disso, discute a solução de problemas, limitação e modificações desses ensaios. Neste estudo, a cepa A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) do vírus H5N1 da GAAP foi usada como exemplo. Para a obtenção dos soros imunes utilizados nos ensaios, esse protocolo selecionou a proteína HA originária da cepa TH como imunogênio para imunizar camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT células são geralmente usadas como células de empacotamento para produzir pseudovírus. A detecção regular de micoplasma é essencial durante a cultura celular. A contaminação por micoplasma pode diminuir drasticamente o rendimento do pseudovírus e, às vezes, próximo de zero. Comparadas com outras contaminações, as contaminações por micoplasma não levam a alterações no valor de pH ou turbidez do meio de cultura celular. Mesmo uma alta concentração de micoplasma não é visível a olho nu ou ao…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de pesquisa do Projeto de Capacitação em Inovação da província de Jiangsu (BM2020019), Projeto Científico e Tecnológico de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), Programa de Pesquisa Estratégica Prioritária da Academia Chinesa de Ciências (XDB29030103), Projeto Científico e Tecnológico de Guangdong (No. 2020B1111340076) e o Programa de Pesquisa Aberta do Laboratório da Baía de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
